5-amaliy mashg’ulot: Bakteriya hujayrasidan plazmid dnk sini ajratish

---

5-AMALIY MASHG’ULOT: Bakteriya hujayrasidan plazmid DNK sini 
ajratish 
 
DNK ajratish uchun namunalar yig’ish, eritmalar va asboblarni tayyorlash
 
Genom 
DNK 
ajratish 
uchun 
eritmalar 
va 
asboblarni 
tayyorlash 
Ishning maqsadi: E.coli bakteriyasi hujayralaridan plazmid DNK sini va odam 
qonidan genom DNK sini hamda DNK namunalarini ajratish printsiplari va usullari 
bilan tanishish.
Ishning vazifasi:E.coli bakteriyasi hujayralaridan plazmid DNK sini va odam 
qonidan genom DNK sini ajratib olish koʼnikmalarini shakllantirish. 
Nazariy qism. Plazmidalar - hujayraning avtonom ravishda replikatsiya boʼladigan 
genetik elementlari boʼlib, xalqasimon tuzilishiga ega DNK molekulasidan iborat. 
Plazmid DNK sini ajratib olish usuli bakteriya plazmidalarining tuzilishi jihatidan 
genom DNK siga nisbatan kichik oʼlchamda boʼlishi va yopiq halqasimon 
koʼrinishga ega boʼlganligiga asoslanadi. Bunda dastlabki bosqich bakteriya 
hujayralariga EDTА va lizotsim (grammanfiy bakteriyalarda) bilan ishlov berib 
ularni sferoplastlarini hosil qilinadi. EDTА metall ionlari bilan xelat hosil qilib, 
DNK ni kationga bogʼliq nukleazalar taʼsiridan himoya qiladi. Olinadigan 
sferoplastlarning tezda lizis boʼlib ketishini oldini olish maqsadida reaktsiyani 
izotonik eritmalar (saxaroza yoki boshqa moddaning ancha yuqori kontsentratsiyasi) 
da olib boriladi. Soʼngra sferoplastlarni lizis qilinadi. Buning uchun, detergentlar 
qoʼshishni tavsiya qilingan. Hujayra qobigʼi bilan bogʼlangan qoldiqlar va bakteriya 
xromosomasining boʼlaklarini sentrifugalash yoki filьtrlash yoʼli bilan olib tashlash 
mumkin. 
Plazmid DNK sini ajratish usullari orasida bakteriyalar hujayralarini ishqor 
yordamida lizis qilish usuli ( Birnboym – Doli usuli ) va uning modifikatsiyalari 
koʼproq ishlatiladi. Bu usuldan mini-preparatlar olishda ham DNK ni yirik hajmda 
ajratib olishda ham keng qoʼllaniladi. Ushbu usul ishqoriy muhitda (~rN 12,0–12,5) 
DNK molekulalarining chiziqli strukturasining denaturatsiyasi (qoʼsh xalqaning 
yozilishi), ayni vaqtda yopiq xalqali molekulalarni esa denaturatsiyaga uchramasligi 
yoki oz miqdorda va qaytar darajada denaturatsiyaga uchrashiga asoslangan. 
Hujayra ekstraktini tuzlarning yuqori kontsentratsiyasida neytrallanganda, oqsillar, 
genom DNK si va hujayra RNK si choʼkmaga tushadi. Bunga tuzlarning yuqori 
kontsentratsiyasida bir zanjirli DNK va RNK molekulalarining denaturatsiyasidan 
keyin tasodifiy va tartibsiz ravishda reassotsiatsiyalanishi sabab boʼladi. Reaktsiyani 
natriy dodetsilsulfat Na (SDS) ishtirokida olib borilganligi uchun hujayra RNK 
sining katta qismi oqsillar bilan birga choʼkmaga tushadi. Preparatdagi (ichki 
molekulyar qoʼsh zanjirli uchastkalari oson hosil boʼlganligi sababli, asosan, 
transport RNK si nisbatan oson renaturatsiyalanadi va tuzning yuqori 
kontsentratsiyasida erib ketadi) hujayra RNK si ning qolgan qismini RNKaza А 
bilan yoʼqotiladi. Sentrifugalash yoʼli bilan choʼkmadan holi qilingan plazmid DNK 

---

sini tiniqlashgan hujayra lizatidan etanol yoki izopropanol yordamida choʼktiriladi. 
Bunday DNK preparatidan bir qancha maqsadlarda, masalan, restriktsion tahlillar 
uchun foydalanish mumkin. Koʼplab alohida tadqiqotlar uchun DNK ning bir 
muncha toza preparativ shakllari zarur boʼladi, masalan, klonlash chun fragmentlar 
tayyorlashda yoki transfektsiyani amalga oshirishda DNK keyingi tozalash 
boqichlari 
oʼtkaziladi. 
Deyarli barcha molekulyar biologik tadqiqotlar uchun muvofiq keladigan kichik 
oʼlchamdagi DNK ning yuqori darajadagi toza preparatlarni olish uchun DNK ni 
shishadan tayyorlangan filьtrli kolonkalarda (glass), kvarts usulida tozalash 
(silicaslurries) yoki silikagelь (silica-gelmembrane) bilan tozalash usullari keng 
qoʼllaniladi. Bunda DNK xaotrop tuzining yuqori kontsentratsiyali eritmasida qaytar 
ravishda shisha membrana yuzasiga sorbtsiyalanadi va qolgan aralashmalarni 
xaotrop tuzi va 70% li etanol bilan yuviladi. Soʼngra tozalangan DNK kichik ionli 
kuchlanishga ega buferda ajratib olinadi (elyuirlanadi). Kam miqdordagi plazmid 
DNK sini yoki uning fragmentlarini xuddi shunday silikat filьtrli sentrifuga mini-
kolonkalarida tozalash usuli ham koʼp qoʼllaniladi. Bunday toʼplamlarni koʼplab 
firmalar 
tomonidan 
ishlab 
chiqariladi. 
Odam genom DNK sini ajratib olishda yadroga ega istalgan hujayradan foydalanish 
mumkin. Odam materiali sifatida koʼpincha leykotsitlar, bukkal hujayralar (yonoq 
epiteliysi hujayralari) qoʼllaniladi. Qanday hujayra ishlatilishiga koʼra, toza 
mahsulotning maksimal miqdorini olishga imkon yaratadigan DNK ajratishning 
optimal usullarini tanlash kerak boʼladi. Genom DNK sini ajratib olish uchun 
plazmatik va yadro membranalarini yorib, hujayra oqsillaridan holi qilinadi. Nuklein 
kislotalardan oqsillarni olib tashlash uchun ularni fenolom va (yoki) xloroform bilan 
eksraktsiya qilinadi. Hujayra lizatlaridan DNK ajratishda oqsillarni yoʼqotish uchun 
koʼpincha oqsillarning keng spektriga nisbatan faol boʼlgan proteolitik fermentlar, 
masalan, proteinaza K bilan gidroliz qilinadi