Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

Kultivační média a roztoky

Kultivační média:

• 
  MRS médium:
  

52 g MRS Broth bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Médium bylo sterilizováno autoklávováním při 121 °C po dobu 15 minut.

• 
  MRS agar:
  

Agar 15 g

MRS médium 1000 ml

Médium bylo sterilizováno autoklávováním při 121 °C po dobu 15 minut.
Roztoky pro barvení buněk podle Grama (podle Jandové a Kotoučkové, 1996):

• 
  Krystalová violeť:
  

10 g krystalové violeti se rozpustí ve 100 ml 96 % ethanolu, doplní se do 0,5 l 1% roztokem šťavelanu amonného. Před použitím se roztok zfiltruje.

• 
  Lugolův roztok:
  

I₂ 1 g

KI 2 g

Destilovaná voda 100 ml

• 
  Karbolfuchsin:
  

Fuchsin bazický 1 g

Ethanol 96 % 10 ml

Fenol – 5 % vodný roztok 100 ml

Přísady se dobře promíchají a zfiltrují.

Roztoky pro izolaci bakteriální DNA z hrubých lyzátů buněk (podle Španové a Ritticha: Učební texty laboratorních cvičení Speciální metody analýzy mikroorganismů I.; nepublikováno):

• 
  Roztok 1:
  

10 mM Tris-HCl (pH 7,8)

5 mM EDTA (pH 8,0)

Roztok se připravuje sterilně ze zásobních roztoků (1 M Tris, pH 7,8, a 0,5 M EDTA, pH 8,0).

• 
  Roztok 2:
  

10 mM Tris-HCl (pH 7,8)

5 mM EDTA (pH 8,0)

lysozym (3mg/ml)

Roztok se připravuje vždy čerstvý.

• 
  Roztok 3:
  

Předestilovaný fenol, jehož pH bylo upraveno pomocí 1M Tris-HCl na 7,8 (nasycený roztok v TE pufru).

• 
  CIZ:
  

Směs chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24:1.

• 
  TE pufr:
  

10 mM Tris-HCl (pH 7,8)

1 mM EDTA (pH 8,0)

Sterilizovat v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut.

• 
  3 M octan sodný (pH 5,2):
  

40,81 g trihydrátu octanu sodného rozpustit v 80 ml destilované vody. Upravit pH na 5,2 ledovou kyselinou octovou. Doplnit destilovanou vodou do 100 ml. Sterilizovat v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut.

• 
  20% SDS:
  

20 g SDS rozpustit v 80 ml destilované vody. Upravit pH na 7,0 několika kapkami koncentrované HCl. Doplnit destilovanou vodou do 100 ml. Nemusí se sterilizovat.
Roztoky pro agarózovou gelovou elektroforézu: (podle Španové a Ritticha: Učební texty laboratorních cvičení Speciální metody analýzy mikroorganismů I.; nepublikováno)

• 
  TBE pufr (5 koncentrovaný):
  

Tris-base 54 g

Kyselina boritá 27,5 g

0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 ml

Výše uvedená množství se smíchají a doplní do 1000 ml destilovanou vodou. Tento zásobní roztok se před použitím ředí 10 destilovanou vodou. Nesterilizuje se.

• 
  Nanášecí pufr (6 koncentrovaný):
  

Bromfenolová modř 0,04 g

Ficoll 400 2,5 g

Destilovaná H₂O 100 ml

Pufr se před použitím ředí vzorkem v poměru 1:5.

• 
  Stop pufr (6 koncentrovaný):
  

Tento pufr získáme smícháním nanášecího pufru s 0,5 M EDTA na výslednou koncentraci 60 mM EDTA. Pufr slouží k inaktivaci restriktáz. Roztok se před použitím ředí vzorkem DNA v poměru 1:5.

• 
  Ethidiumbromid (EtBr):
  

Zásobní roztok: 5 mg/ml (uchovávat ve tmavé nádobě)

Barvící roztok: 1 g /ml

• 
  Agarózový gel pro gelovou elektroforézu:
  

0,8%: 0,8 g agarózy/100 ml 0,5 koncentrovaného TBE pufru

1,5%: 1,5 g agarózy/100 ml 0,5 koncentrovaného TBE pufru

Roztoky pro separaci DNA pomocí magnetických nosičů:

• 
  70% ethanol:
  

Smíchat 50 ml 96 % ethanolu a 18,57 ml destilované vody.

• 
  5 M NaCl:
  

292,2 g NaCl rozpustit v 800 ml destilované vody. Doplnit destilovanou vodou do 1000 ml. Sterilizovat v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut.

• 
  40% Poly(ethylen glykol) 6000:
  

40 g PEG 6000 rozpustit v 60 ml destilované vody. Doplnit destilovanou vodou do 100 ml. Sterilizovat v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut. Uchovávat při 4 °C.

• 
  2 koncentrovaný PBS (pufrovací fyziologický roztok, phosphate-buffered saline)
  (4 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,2% Tween 20) :
  

5,5 M NaCl 72,7 ml

1 M Tris-HCl (pH 7,8) 2,0 ml

0,5 M EDTA (pH 8,0) 0,4 ml

20% Tween 20 1,0 ml

Sterilní destilovaná voda 23,9 ml

• 
  1 koncentrovaný PBS:
  

K 50 ml 2 koncentrovaného PBS přidat 50 ml sterilní destilované vody.

4. Přístroje a pomůcky

• 
  Analytické váhy Denver Instrument PK-202 (Denver Instrument, Gottingen, SRN)
  
• 
  Biohazard box Telstar Biostar (Telstar, Barcelona, Španělsko)
  
• 
  Centrifuga Universal 30 RF, EBA 12R (Hettich, Teittlingen, SRN)
  
• 
  Digitální fotoaparát Kodak EDAS 290 (Eastman Kodak, Rochester, USA)
  
• 
  Exikátor typ N 86 KN.18 (KNF Neuberger Labport, Freiburg, SRN)
  
• 
  Magnetický separátor Dynal MPC-S (Dynal Biotech, Oslo, Norsko)
  
• 
  Mikropipety LABMATE o objemu 10 l, 100 l, 1000 l (PZ HTL, Varšava, Polsko)
  
• 
  Mikrovlnná trouba model DA4 (Moulinex, Francie)
  
• 
  Laboratorní váhy Sartorious typ E2000D (Gottingen, SRN)
  
• 
  PCR purifikační kit QIAquick
  
• 
  Spektrofotometr ND-1000, NanoDrop
  
• 
  Spektrofotometr DMS-100S (Varian Techtron, Mulgrave, Austrálie)
  
• 
  Světelný mikroskop Olympus BX50 (Olympus, Tokyo, Japonsko)
  
• 
  Termocykler PTC-100^TM (MJ Research , Watertown, USA)
  
• 
  Termomixer compact 3550 (Eppendorf AG, Hamburg, SRN)
  
• 
  Termostat BT 50, termostat BT 120 (Laboratorní přístroje, Praha, ČR)
  
• 
  Transilluminátor EB 20E (Ultra Lum, Paramount, USA)
  
• 
  Zdroj elektrického napětí pro elektroforézu Biometra Standard Power Pack P25 (Whatman Biometra, Gottingen, SRN)
  
• 
  Běžné laboratorní sklo, umělohmotný materiál a běžné laboratorní pomůcky
  

5.