Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

4výsledky

1. Kultivace a mikroskopická charakteristika bakteriálních buněk

Příslušné tři bakteriální kmeny druhu Lactobacillus paracasei byly nakultivovány dle kapitoly 3.5.1. Poté byl zkontrolován vzhled kolonií, který byl pro daný rod charakteristický. Z těchto bakteriálních kmenů byly zhotoveny fixované preparáty, obarveny podle Grama (dle kapitoly 3.5.2) a mikroskopicky pozorovnány. Takto byla zkontrolována morfologie buněk, která byla pro rod typická.

2. Izolace bakteriální DNA pomocí fenolové extrakce

Bakteriální DNA byla izolovaná dle postupu uvedeného v kapitole 3.5.3. Na agarózový gel byly naneseny jak hrubé lyzáty buněk, tak DNA purifikována pomocí fenolové extrakce. Pomocí agarózové gelové elektroforézy byla ověřena intaktnost izolované DNA (Obrázek 5).

O
1 2 3 4 5 6

chromozomální DNA
brázek 5. Agarózová gelová elektroforéza DNA izolované ze 3 kmenů druhu Lactobacillus p aracasei. Na gelu bylo analyzováno 20 l DNA z hrubých lyzátů buněk a 20 l purifikované DNA.

RNA

	Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost DNA
Hrubé lyzáty buněk	1	CCDM 211/06	+
	2	CCDM 212/06	+
	3	CCDM 213/06	+
Purifikovaná DNA	4	CCDM 211/06	+
	5	CCDM 212/06	+
	6	CCDM 213/06	+

+…DNA byla detekována

 Ve všech vzorcích byla detekována přítomnost genomové DNA. DNA izolovaná metodou fenolové extrakce byla relativně intaktní. Kromě DNA byla na gelu vizualizována i RNA.

3. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA

U všech vzorků DNA izolované pomocí fenolové extrakce byla spektrofotometricky změřena absorbance v rozmezí vlnových délek 220–320 nm a stanovena koncentrace a čistota DNA (Tabulka 5) dle kapitoly 3.5.4.

Tabulka 5: Spektrofotometrické měření DNA izolované ze tří kmenů druhu Lbc. paracasei pomocí fenolové extrakce a stanovení její čistoty a koncentrace.

Kmen Lactobacillus paracasei	Čistota DNA (A260/ A280):	Koncentrace DNA [ng/l]:
CCDM 211/06	2,13	72,0
CCDM 212/06	2,09	83,4
CCDM 213/06	2,04	92,9

 Izolovaná DNA ze všech uvedených bakteriálních kmenů byla v dostatečné koncentraci. Vzrůst poměru absorbancí nad hodnotu 2,0 poukázal na přítomnost RNA ve vzorku. Tato DNA byla následně použita jako matrice v rodově specifické PCR.

4. Rodově specifická PCR

DNA byla naředěna na 10ng/ml až 100 fg/ml a následně amplifikována pomocí PCR s rodově specifickými primery LbLMA1-rev a R16-1 (dle kapitoly 3.5.6). Byla stanovena citlivost PCR, tj. nejnižší množství DNA, co dává PCR produkt detekovatelný na gelu. Výsledné produkty délky 250 bp byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy, všechny s pozitivním výsledkem (Obrázek 6).

Obrázek 6: Agarózová gelová elektroforéza PCR produktů amplifikovaných pomocí rodově specifických primerů pro rod Lactobacillus. Jako DNA matrice byla použita DNA různé koncentrace
(1 l) tří bakteriálních kmenů. Na gelu bylo analyzováno 15 l PCR produktů.

14 15 16 1718 19 2021

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Kmen Lbc. paracasei	Běh č.:	Koncentrace DNA	Detekce PCR produktů
	1	DNA standard	*
CCDM 211/06	2	10 ng/ml	+++
	3	1ng/ml	++
	4	100 pg/ml	+
	5	10 pg/ml	+
	6	1 pg/ml	+
	7	100 fg/ml	+
CCDM 212/06	8	10 ng/ml	+++
	9	1ng/ml	++
	10	100 pg/ml	++
	11	10 pg/ml	+
	12	1 pg/ml	+
	13	100 fg/ml	+
	14	DNA standard	*
CCDM 213/06	15	10 ng/ml	+++
	16	1ng/ml	+++
	17	100 pg/ml	++
	18	10 pg/ml	++
	19	1 pg/ml	+
	20	100 fg/ml	+
	21	negativní kont.	-

+++..PCR produkt detekován silně

++…PCR produkt detekován zřetelně

+…..PCR produkt detekován slabě

-…..PCR produkt nedetekován

*…..DNA standard 100 bp

 Po amplifikaci DNA matrice o koncentraci 10 ng/l až 100 fg/l byly na gelu detekovány PCR produkty různé intenzity.

5.