Synaptic elimination and the complement system in

Jonny Daborg 

25 

Hypothesis  testing  can  be  made  by  use  of  a  vast  number  of  more  or  less 

complicated statistical methods. Statistical software enables non-statisticians 

to  perform  the  tests  without  knowledge  about  the  actual  calculations. 

However,  this  comes  with  the  risk  of  performing  wrong  tests  and  making 

faulty  conclusions.  This  possible  limitation  has  been  restricted  by  seeking 

advice from relevant experts in the field. 

Since falsely significant differences are identified by chance according to the 

chosen significance level, and this applies to each test being made, it is often 

advisable  to  correct  the  p-value  for  multiple  testing  when  several  tests  are 

made. The easiest way to do this is by use of the Bonferroni method, where 

the  p-values  are  simply  multiplied  by  the  number  of  tests  that  were 

performed.  However,  these  methods  are  often  very  conservative,  as  a 

consequence real differences might be discarded. 

Alleles in a randomly mating population without any evolutionary selection 

pressures  will  occur  in  stably  fixed  proportions.  This  is  called  Hardy-

Weinberg  equilibrium.  In  the  gene  association  studies,  Hardy-Weinberg 

equilibrium  was  assessed  by  comparing  theoretical  genotype  distributions, 

calculated  on  the  basis  of  observed  allele  frequencies,  with  observed 

genotype  frequencies  using  χ

2

-test.  This  ensures  detection  of  genotyping 

errors  that  could  otherwise  lead  to  false  associations.  However,  Hardy-

Weinberg  disequilibrium  might  also  reflect  natural  selection  as  a 

consequence of an actual association. 

In gene association studies, risk estimations for carriers of the susceptibility 

gene are relevant, not only to estimate the risk, but also as a measure of the 

effect  size  of  the  studied  gene.  Since  most  diseases  are  uncommon,  a 

randomly selected cohort or a selection of carriers and non-carriers, are very 

impractical because of the large sample size needed in such approaches. The 

common  way  is  instead to  use  a case-control  design.  However,  this  means 

that a proper risk ratio cannot be calculated, since the study population was 

not randomly selected from the whole population. Instead an odds ratio (OR) 

has to be used. The OR represents the risk of an outcome and is interpreted in 

relation to 1 which means that the subject under study has no effect on risk. 

An OR of more than 1 means an increased risk, whereas an OR of a number 

less than 1 should be interpreted as protective. 

---

Synaptic elimination and the complement system in Alzheimer’s disease 

26 

4

 

SUMMARY OF RESULTS 

4.1

 

Association of RAGE with AD diagnosis 

In an attempt to provide a link between recent animal studies showing that 

the  RAGE  receptor  mediates  the  LTP  inhibiting  effect  of  Aβ,  and  actual 

human  AD  patients,  we  investigated  the  genetic  variability  in  the  gene 

encoding  RAGE  (somewhat  confusingly  the  gene  is  named  advanced 

glycation end-products receptor (AGER)), and it’s relation to AD. 

While  working  on  this  project,  a  study  (Li  et  al.  2010a)  on  the  very  same 

subject  was  published.  This  group  showed  an  association  of  the  functional 

82S SNP with AD in a Chinese cohort. In the field of genetics this is actually 

a  good  thing,  since  independent  replications  in  separate  populations  are 

needed.  In  contrast  to  the  study  by  Li  et  al.  (2010)  all  AD  cases  in  our 

material  were  neurochemically  confirmed  and  of  European  origin  (further 

demographics are given in Table 1, paper I). 

Our  study  investigated  some  additional  SNPs  in  AGER  (Table  2,  paper  I), 

although  none  of  these  were  associated  with  AD,  the  82S  allele  was 

associated with an increased risk of AD (Pc=0.04, OR=2.0, 95% CI 1.2–3.4) 

(Table 3, paper I). There was no genetic interaction between AGER 82S and 

APOE ε4 in producing increased risk of AD (p=0.21) (Table 4, paper I), and 

none of the AGER SNPs showed association with Aβ42, T-tau, Ptau181 or 

MMSE scores. 

RAGE  may  affect  both  production  and  accumulation  of  Aβ  in  the  brain 

(Chaney  et  al.  2005;  Cho  et  al.  2009;  Deane  et  al.  2003).  Since  the  82S 

variant  of  RAGE  has  an  increased  ligand-binding  affinity  (Hofmann  et  al. 

2002;  Osawa  et  al.  2007)  this  could  lead  to  increased  signalling,  which  in 

turn,  would  accelerate  APP-processing  through  BACE1  (since  BACE1  has 

been  shown  to  be  positively  regulated  by  RAGE  (Cho  et  al.  2009)),  and 

thereby increase Aβ production. An increased transport of peripheral Aβ into 

the  brain  would  be  expected  as  well,  since  RAGE  has  been  shown  to 

transport Aβ across the blood-brain barrier into the brain (Deane et al. 2003). 

However, we found no association between G82S genotype and Aβ levels. 

Another possibility is that the 82S variant may be more effective in mediating 

the  LTP-inhibiting  effect  of  Aβ  (Arancio  et  al.  2004;  Origlia  et  al.  2009; 

Origlia et al. 2008), a hypothesis that remains to be tested. 

---

Jonny Daborg 

27 

In conclusion, the present results, together with those from Li et al. (2010), 

suggest that AGER is a susceptibility gene for AD. 

4.2

 

Complement mediated synapse 

elimination in the hippocampus 

The  complement  system  has  been  shown  to  be  involved  in  elimination  of 

retino  geniculate  synapses  (Stevens  et  al.  2007)  and  synapses  in  the 

sensorimotor cortex (Chu et al. 2010) of mice. 

Considering  that  the  first  brain  region  to  be  affected  in  AD  is  the 

hippocampus, and that loss of synapses is perhaps the most relevant feature 

of the disease; investigation of the mechanisms of synapse elimination in the 

hippocampus is highly warranted. 

Thus we decided to investigate if the number of synapses is altered in mice 

lacking  C3.  The  hypothesis  was  that  these  mice  should  have  an  increased 

number of synapses as a result of impaired synaptic elimination. 

An  increased  number  of  synapses  should  lead  to  an  increased  synaptic 

efficacy, when measured as the average synaptic response to a given number 

of stimulated axons. Surprisingly, the input/output measurements showed no 

difference between C3 KO and WT animals (Fig. 1, paper II). However, there 

was  an  increased  PPR,  indicating  lower  release  probability  in  the  C3  KO 

mice (Fig. 2, paper II). According to the formula for synaptic efficacy, n*p*q, 

a decreased release probability could potentially mask an increased synapse 

number. In order to ascertain the decreased release probability in the C3 KO 

mice, we recorded NMDAR EPSPs in the presence of MK-801. The resulting 

MK-curves showed that the release probability was indeed lowered (Fig. 3, 

paper II), thus supporting the original hypothesis that C3 KO mice have an 

increased number of synapses. 

This conclusion assumes that the quantal size remain unchanged. To test this, 

we made whole cell patch clamp recordings of miniature EPSCs. Since no 

difference in the size of the AMPAR EPSCs was observed (Fig. 4, paper II), 

we conclude that quantal size is not changed in C3 KO mice. In conjunction 

with  a  decreased  release  probability  and  unaltered  input/output,  the  only 

sensible  conclusion  is  that  the  C3-deficient  mice  must  have  an  increased 

number of synapses. 

---