Histolojiye Giriş Pof. Dr. Alpaslan GÖKÇİmen

Histolojiye Giriş

• Pof. Dr. Alpaslan GÖKÇİMEN

• Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı

Histoloji Nedir ?

• Ülkemizde histoloji terimi embriyoloji ile birlikte, Histoloji ve Embriyoloji adı altında kullanılmaktadır. Histoloji, histos (doku) ve logia (bilim) kelimelerin birleşmesiyle türemiştir. Dilimizdeki karşılığı Doku Bilimidir. Latin alfabesine geçilmeden önce İlm-i Ensaç (dokular) veya Fenn-i Ensaç olarak isimlendiril miştir. Embriyoloji, embrio (cenin) ve logia kelimelerinden oluşmuştur. Türkçemizdeki karşılığı ise, Cenin (dölet) Bilimi’dir. Embriyoloji terimi, eğitimin ilk yıllarında Mebhas-ül Cenin adı ile belirtilmiştir.

Histoloji Nedir ?

• Histoloji bilimine, mikroskopik anatomi de denmektedir. Histoloji biliminde, bir mikroskop yardımıyla biyolojik materyal ve yapılar incelenir. İncelenecek yapı hücre (sitoloji), doku (histoloji) ve organ (organoloji) bazında olmak üzere üç alt bölüme ayrılır. Histoloji hücre, doku ve organ bilimi olduğuna göre, bunların yapılarının yanı sıra işlevlerini de ele alacaktır. Bu yüzden, histoloji sadece yapıyı tanımlamakla kalmaz, aynı zamanda biyokimya, moleküler biyoloji ve fizyoloji arasında bağlantılar kurar ve hastalık ile ilgili patogenezde önemli rol oynar.

Histolojik İnceleme Nasıl Yapılır ?

• Ana gereç  Mikroskop

• Materyaller, mikroskopta incelenmeden önce, aşağıda belirtildiği şekilde elde edilir:

• İğne Biyopsisi: Beyin, göz, tiroid, lenf düğümü, meme, akciğer ve plevra, böbrek, kemik ve kemik iliği, testis ve iskelet kası.

• Endoskopik Biyopsi: Solunum yolu, mide ve barsak yolu, üriner sistem yolu.

• Transvasküler Biyopsi: Kalp ve karaciğer

• Doğrudan Çıkarım Biyopsisi: Deri, ağız, larinks ve serviks uteri.

• Kürete Biyopsisi: Uterus endometriyumu.

Histolojik İnceleme Nasıl Yapılır ?

• Alınan biyolojik materyaller, belli aşamalardan geçirilir. Bunları, şu şekilde sıralayabiliriz:

• (1) Tespit (Fiksasyon)

• (2) Yıkama

• (3) Suyunu giderme (Dehidrasyon)

• (4) Parlatma veya Şeffaflaştırma

• (5) Emdirme

• (6) Gömme veya blokaj (Bloklama)

• (7) Kesme

• (8) Boyama

• (9) Kapatma

• Sırasıyla izlenen bu aşamaların her birinde, öngörülen şartlara uyma zorunluluğu vardır. Bunlardan birinde yapılan bir hata, neticeyi menfi yönde etkiler ve uygun bir preparat elde edilemez.

Tespit İşlemi

• Diğer anlamı  Sabitleme (Fiksasyon)

• Hücre veya dokuların, alındığı gibi saklanması

• Eğer bu sağlanmazsa  Bozunma olur.

• En önemli unsur  Dokudaki proteinlerin çökmesi

Tespit İşlemi

• Sabitleyiciler (Fiksatörler):

• Fiziki: Isı, kurutma ve dondurma

• Kimyasal: Formaldehit, osmik asit, pikrik asit, asetik asit, alkol, civa klorür, v.s

Yıkama

• Uygulanan tespit çeşidine göre yapılır.

• Su veya değişik yoğunluklarda alkol kullanılır.

• Formol, osmiyum tetraoksit ve krom tuzu içeren tespitlerden sonra, yıkama aşamasında su kullanılır.

• Pikrik asitle gerçekleştirilen tespitler den sonra, % 70 – 80’lik alkol ile yıkama yapılabilir.

Suyu Giderme (Dehidrasyon)

• Parafine gömülecek olan dokuların, yıkamadan sonra içerisinde hiç su kalmaması gerekir.

• Bu amaçla, en yaygın olarak etil alkol kullanılır. Etanol, dokulardaki suyu çeker.

• Dokular, sırayla artan derecelerde alkol serisinden geçirilir.

Şeffaflaştırma (Parlatma)

• Şeffaflaştırmanın temel amacı, dokuya nüfuz etmiş olan alkolün yerine, ışığı kırma endeksi daha yüksek olan bir sıvı ayıracın konmasını sağlamaktır.

• Ksilol, bu amaçla en yaygın olarak kullanılan ve nisbeten daha ucuz olan bir maddedir.

Emdirme

• Parlamış ve şeffaf duruma gelmiş doku parçalarına parafin, plastik madde veya selloidin emdirilir.

• Böylece, bir sonraki gömme aşaması öncesinde, blokaj maddesinin dokulara iyice nüfuz etmesi sağlanır.

Gömme (Bloklama)

• Emdirme maddesi dokuların içine iyice nüfuz ettikten sonra, bu dokular yine aynı maddenin içine gömülürler.

• Bu amaçla, özel kalıpların içine emdirme maddesi doldurulur.

• Sıvı durumdaki bu maddenin içine, kesit yüzleri üzerine oturtulmak şartıyla doku parçaları yerleştirilir.

Kesme

• Emdirme maddesinin içine gömülerek homojen biçimde sertleşmiş olan blok kitlesi (doku ve emdirme maddesi), mikrotom adı verilen özel bir aletle kesilir

• Bunların günlük pratikte en çok kullanılanları ise, kızaklı veya rotatif (dönerli) mikrotom tipleridir. Bu aletlerde kullanılan çelik bıçaklar (mikrotom bıçakları) da, özel şekilde üretilmiştir.

• Ayrıca, çok pahalı olan elmas uçlu bıçaklar da kullanılmaktadır. Mikrotomlarda, (tiplerine göre) 1 – 10 mikron kalınlığında kesitler alınır.

Boyama

• Dokuların genellikle çoğu boyasız olup, bunların incelenmesi için öncelikle boyanmaları gerekmektedir.

• Aynı zamanda, bu yolla kimyasal maddeler de belirlenebilir.

• Boyamalar, amaca uygun olarak yapılır.

• En basit boyamada, hücrelerin iki temel öğesi ayrı özellikteki boyalarla boyanır ve şekilli oluşumlar, mikroskop altında görülebilir hale gelir. Buna göre, rutin boymada çekirdek hematoksilenle ve sitoplazma eozinle boyanır.

Boyama

• Histolojik kesitlerde kullanılan boyalar, suda veya alkolde çözünen ve anyon ve katyonlarına ayrılabilen tuzlardır.

• Eğer boya taşıyıcı organik grup katyonda ise buna katyonik veya bazik boya, anyonda ise buna da anyonik veya asidik boya denir.

• Bazik boyalarla boyanan hücre elemanlarına bazofilik, asit boyalarla boyananlara ise asidofilik denir. Asidik ve bazik boyalar, histoloji pratiğinde genellikle ardışık olarak kullanılırlar.

Boyama

• Bazik boyalar dokulardaki negatif yüklü ve asidik reaksiyonlu kısımlar tarafından, asidik boyalar ise pozitif yüklü bazik kısımlar tarafından tutulur.

• Genelde, bazik boyalar mavi-mor ve asidik boyalar ise pembe-kırmızı renk verirler.

Boyama

• 1- Asidik Boyalar: Eozin, pikrik asit, asit fuksin, orange G, eritrosin, Kongo kırmızısı ve light green

• 2- Bazik Boyalar: Thionin, hematoksilen, metilen mavisi, toluidin mavisi, bazik fuksin, jansiyon viyole ve safranin

Boyama - PAS

• Glikojen, müköz salgı ve glikoproteinlerde bulunan 1,2-glikol veya 1,2-aminoalkol gruplarının ve dolayısıyla aldehit gruplarının gösterilmesinde kullanılır. Önce, periyodik asit ile dokular okside edilir ve aldehit grupları açığa çıkarılır. Bu aldehit grupları, daha sonra sodyum metabisülfit ile renksizleştirilen bazik fuksin (ağartılmış fuksin) ile yapılan Schiff ayıracı ile reaksiyona girer. Böylece, söz konusu aldehit grupları renkli fuksine dönüşür. Bu kısım, koyu pembe-mor (leylak renginde) görülür.

Boyama - PAS

• Polisakkaritler: Glikojen, nişasta ve selüloz

• Nötral mukopolisakkaritler: Mide müsini, bazal membran salgıları, hipofizin gonadotrop hormon salgılayan hücreleri, tiroid bezinde mevcut olan tiroglobulin gibi glikoproteinler.

• Glikolipitler: Pek çok hücre zarının öğesidirler ve sinir hücrelerinin plazma zarının önemli bileşen kısmını oluştururlar.

• Doymamış lipit ve fosfolipitler

• Bazal membran

• Glikokaliks

• Goblet hücrelerince üretilen müköz salgı

• Kollajenler

Boyama - Feulgen

• Çekirdek DNA’sını göstermek için kullanılır. Kullanılan yöntem, PAS boyasına çok benzer. Doku HCl ile okside olduğu zaman, pürin şekerden ayrılır ve aldehit grupları açığa çıkar.

• Açığa çıkan bu gruplar, yine Schiff ayıracı ile boyanır ve DNA kırmızı renk alır. DNA ve RNA, birbirlerinden metil green (yeşili) – pironin boyası kullanılması yoluyla ayırt edilebilir. RNA pironin ile kırmızı, DNA ise metil yeşiliyle mavimsi - yeşil renkte boyanır.

Boyama - Lipit

• Lipitler, ksilenin normal kesitlere girmesi durumunda erirler ve dolayısıyla, % 10’luk veya nötral formalinle tespit edilirler. Doku dondurulur ve dondurma mikrotomunda kesitler alınır. Eğer yağ dokusu osmiyum tetraoksitle tespit edilirse, siyah renkli osmiyum yağ dokusuna çöker ve oksidasyon reaksiyonu meydana gelir. Sonuçta, osmiyum dioksit açığa çıkar ve dokulara siyah renk verir. Lipitler Sudan III, Sudan IV, şarlak ve Oil Red 0 ile kırmızıya, Sudan Black ve osmiyum tetraoksitle de siyaha boyanır.

Boyama - Metakromazi

• Boyaların çoğu ortokromatiktir. Yani, bütün doku boyanın rengini alır. Yalnız, bazı boyalar dokuları veya doku elemanlarını boyanın renginden daha farklı bir renge boyarlar. Bu olaya metakromazi, bu boyalara da metakromatik boyalar denir. Bunlar toluidin mavisi, thionin, metilen mavisi ve azure A gibi bazik ve anilin boyalardır.

Mikroskop - Özellikler

• Büyütme: Objektif ve oküler ile sağlanır. Objektif mercek, ilk büyütmeyi sağlar. Oküler mercek ise, ilk büyütmeyi tekrar büyütecek şekilde cihaza yerleştirilmiştir. Objektif ile oküler mercek büyütmelerinin çarpımı toplam büyütmeyi verir. Oküler mercek yaygın olarak 10’luk büyütme yapar. Işık mikroskobu en fazla 2000 büyütme gücüne sahiptir. Az büyüten objektiflerle çok büyüten oküler, çok büyüten objektiflerle az büyütme sağlayan oküler kullanılmalıdır. Genellikle bu durumun tersi uygulanır. Böyle bir uygulamada, objektifin çözünürlük gücünü artırmış olamayız. Sadece, objektifin gösterebildiği ayrıntıları lüzumundan fazla büyütmüş oluruz. Bu duruma, boş büyütme denir.

Mikroskop - Özellikler

• Rezolüsyon (Çözünürlük) Gücü: Birbirine bitişik iki noktayı, ayrı iki nokta halinde gösterebilme gücüdür. Bu değer, ışık mikroskobunda yaklaşık olarak 0.2 mikrondur. Dolayısıyla, ışık mikroskobun da hücrelerin ince ayrıntıları ortaya çıkarılamaz. Bunun için, elektron mikroskobunda tungsten filamanınca üretilen ve gözle görülmeyen elektronlar kullanılır.

Mikroskop - Özellikler

• Sayısal Değer: Lens açılımının genişliği ile ilgilidir. Sayısal değer büyüdükçe, çözünürlük gücü artar.

• Kırılma Endeksi: Işığın değişik ortamlardan geçerken hızında meydana gelen değişiklik oranıdır. Çözünürlük, yüksek büyütme oranlarında ışığın kırılma endeksine bağlı olarak düşer. Bu durumda, camla aynı kırma endeksine sahip olan immersiyon yağı gibi bir madde kullanılır ve böylece, ışığın aynı kırma endeksine sahip ortamda yol alması sağlanır.

• Lensle İlgili Artefaktlar: Lense ait değişik nitelikte istenmeyen oluşumlar gözlenebilir.