İlham Məmmədov, Aydın Əhmədov Nəcməddin Məmmədov
Yüklə 336 Kb. Pdf görüntüsü
|
+ - hüceyrə periferiyasında zəif sarımtıl-yaşıl və ya bozum tul işıq saçma. İm m unoferm ent analizi. /İFA /. İFA- modifikasiya qru pundan ibarət olub buna ELİSA üsulu /enzimə-Linked immuno sorbent assay/ aiddir. Bu üsulun mahiyyəti antigen və antitellə- rin nişalanması üçün fermentlərdən istifadə olunmasıdır. Bu üsuldan quşların infeksion, şiş və digər xəstəliklərinin ilk dövr lərinin diaqnosikasında, quşçuluq təsərüfatlarda epizootik və ziyyətin müəyyən edilməsində, postvaksinal antitellərini sə viyyəsinin təyinində, bioloji və mikrobioloji sənayenin məhsul larının keyfiyyətinə nəzarət edilməsində və s. istifadə edilir. Hal-hazırda daha çox İFA-nın bərkfazalı variantı və o cümlədən ELİSA tətbiq edilir. ELİSA-nın aşağıdakı şəkildəyişmələri mövcuddur: rəqib ELİSA, «sendviç»-ELİSA /ikiqat antitel üsulu/ modofıkasiyası «sendviç»-ELİSA, vasitəsiz ELİSA və s. Vasitəsiz ELİSA o vaxt tətbiq olunur ki, tədqiqatçı az miq darda antitellə üzləşir. Bu variantda növəleyhinə nişanlanmış antitel götürülür. «Sendviç » ELİSA metodunun əvvəlki metod dan bir çox üstünlüyü mövcuddur. Birinci müxtəlif antigenlərin aşkar edilməsi üçün yalnız bir nişanlanmış növəleyhinə serum- dan istifadə edilir. İkinci, təmizləmə və markirovka təcrübəsin də çoxlu miqdarda nadir spesifik serum sərf olunmur, halbuki antiqlobulinlər həmişə kifayət miqdarda olur. Üçüncü, ikiqat «sendviç» yüksək dərəcədə həssaslığa malikdir, çünki spesifik antitelin bir malekulası bir neçə malckula nişanlanmış antiqlobu- Iinlə reaksiya verir, bu da siqnalın güclənməsinə səbəb olur. Nişanlanmış antitelləri istifadə etməklə kəmiyyət immunoa- nalizlərinin bütün variantları aşağıda göstərilən üsütnlüklərə malikdir. 1) Antigen nişanlanmır, ona görə də onun zədələnmə- si və ya fiziki kimyəvi xüsusiyyətlərinin dəyişməsi qeyd olun mur. 2) Antitel molekulları daha çox stabildir, nişanlama zama 70 nı o qədər də zədələnm ir və radiozitoplarla nişanlanan zamanı radiolizə daha çox davamlılıq göstərir. 3) Çətin nişanlanan və ya təm iz halda alınması çətin olan antigenləri təyin etmək mümkündür. 4) nişanlanmış antitellərin çox istifadə edilməsi nəicəsində daha çox həssaslıq və spesifiklik müşahidə edilir. Antitellər. Serumların qiymətləndirilməsi göstəriciləri bun lardır: avidlik, spesifiklik və əlverişlilik KBR-da istifadə edilən aşağı titrli serumlar çox vaxt İFA üçün kifayət qədər spesifik ol mur. Bərk fazalı kəmiyyət immunitestlərində həm bərk fazanın hazırlanması və həm də nişanlanma üçün ya - qlobulin fraksiya sını və ya L q G.yaxud da immunosorbsiya nəticəsində alınmış təmiz antitellər istifadə edilir. Bərk cisimlər. Nişanlanmış reagentlər istifadə edilən kə miyyət immunoloji metodlarla azad və əlaqəli nişanlanmanın ayrılması mərhələsi çox vacibdir ki, bura da ən sadə üsul bərk- fazalı üsul hesab edilir. Bərk fazalı daşıyıcılar kimi sintetik poli- merlər - polistirol, polipropilen, plivinil, dakreil və s. istifadə edilir. Yuvulma mərhələləri. ELİSA tip heterogen ferment immu- noanalizləri müxtəlif reagentlərin bir sıra seriyasından ibarətdir və burada ardıcıl şəkildə yuylma elə aparılmalıdır ki, reagentin bir mərhələdən digərinə keçilməsi tam təmin edilmiş olsun. Müxtəlif borucuqlar, planşetlər və s. məhluldan azad edilir və tərkibində tvin-20 olan fosfat-bufer məhlulunun içərisində müəyyən qədər saxlanır. Üç dəfə belə ardıcıl yuyulmadan sonra planşet və digər polimer daşıyıcılarını qurudur və digər reagen- ti əlavə edirlər. Nəzarət nümunələri. Yüksək pozitiv nümunənin göstəricisi nin JFA vasitəsiz variantında neqativ göstəriciyə olan nisbəti 5:1-ə olmalıdır. Serum nümunəsinin vasitəsiz nəzarətində digər serum komponentləri ilə reaksiya verən sustansiyalar ola bilər 71 ki, bu zaman xromotoqrafıya, sentifıquraladınna və ya hər bir immunoqlobulinə spesifik olan adsorbentlərdən istifadə etm ək lə 1 q M və ya 1 q G-nin ayrılması meydana çıxır. Fennentlər və substar sistemləri. Marker kimi götürülən fer- mentlər stabil, yüksək reaktiv, təmiz, ucuz və tətbiqi zamanı ucuz olmalıdır. Belə təlabatlara peroksidaza, qələvi fosfataza, asetilxolines- teraza, ribonukleaza və s. cavab verir. Permentin seçilməsi təb- qiq olunan materialın xüsusiyyətlərindən və onun tədqiqi müddətindən asılıdır. Eyni vaxtda çoxlu miqdarda nümunənin analizi zamanı hansı ki, birinci və sont nümunənin tədqiq olun ma müddəti tamamilə fərqlidir ELİSA metodun xətası arta bilər. Belə hallarda daha çox stabil hidrolitik fermentləri, yəni qələvi fosfatazanı və - qalaktozidazanı götürmək lazımdır. Nümunədə olan aktivator və ingibitorlardan asılı olan ferm entlərin göstürülməsi məsləhət bilinmir. Substraf kimi qələvi, fosfataza üçün daha çox nitrofenolfos- fat uyğun gəlir. Bu həb şəklində buraxılır və bundan asanlıqla və həmiz halda işçi məhlul hazırlamaq mümkündür. Peroksida- zanı aşkar etmək üçün ən yaxşı substar ortofenilendiamin hesab edilir. Ümumiyyətlə qələvi fosfataza və - qalaktozidaza ilə nişanlan mış antitellərlə birlikdə ELİSA sistemi daha dəqiq nəticələr verir. Fermentin zülalla konvuqasiva metodu. Fermentin antigen və ya antitellə birləşməsi elə həyata keçirilməlidir ki, bunların hər biri maksimal miqdarda öz aktivliyini saxlaya bilsin. Bu məqsədlə ən azı iki olaraq aktiv qrupla birləşə bilən agent tətbiq olunur. Belə agntlərə misal qluitaraldehidi, natrium-peryodenti göstərmək olar. Nəticələrin vizual şəklində təyini o vaxt tətbiq olunur ki, bu rada «hə» və «yox» cavabı verilsin. Nəticələrin fotometrik üsulla təyini daha dəqiqdir. Burada optiki sıxlıq / M + ) göstə 72 riciləri styudet kriterisinə müvafiq olaraq müəyyənləşdirilir. ELİSA-nın avtomatlaşdırılması məşədilə «Dinatec» tipli aparatlardan istifadə edilməsi məqsədə müvafiqdir. Diaqnostik dəst preparatları bir neçə tipə bölünür: 1. Virus antigenləri / orqan və ya kulturalar ) 2. Peroksidaza ilə konyuqasiya edilmiş növ əleyhinə toyuq immunoqlobulini 3. Təyin olunan virusa görə təzə və ya liofilizasiya olunmuş nəzarət hiperimmun serum. 4. Toyuqların təzə və ya liofilizasiya olunmuş nəzarət mənfi serumu. 5. Nəzarət mənfi antigen. Tədqiqat işində PH 7,4 olan 0,01 M fosfat-bufer məhlulun dan istifadə edilir. Bundan yuma məqsədilə və indikator sistemi üçün 2 bufer hazırlanır. Yuyucu bufer - tərkibində 0,5 % tvin-80 olan fsfat-bufer məhluludur. İndikator sistemi üçün bufer tətbiq olunmazdan əvvəl tünd şüşə daxilində hazırlanır.hər 40 ml fosfat-bufer məhluluna 40 mq 5-aminazalisil turşusu 100 mq əküz serumu albimini əlavə edilir. Reaksiyanın gedişi aşağıdakı kimi həyata keçirilir. 1. Peroksidaza ilə nişanlanmış növ əleyhinə tovuq embrionu- nun titrləsdirilməsi. l:10-də ilk durultma hazırlanır və bundan isə planşetin gözcükləində 1:1000 və daha çox durultma dərəcə ləri fosfat bufer məhlulu və normal serumu istifadə etməklə ha zırlanır. 37° S temperaturda 2 saat müddətində inkubasiya etdiri lir. Sonra planşetin gözcükləri yuyucu buferlə 3 dəfə yuyulur. Sonra hər durultmaya bərabər həcmdə indikator sistemi buferi tökülür. 37u S temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya edildikdən sonra nəticəsi yoxlanır. İntensiv palıdı rəng və bunun qara rəngə çevrilməsi baş ve 73 Yüklə 336 Kb. Dostları ilə paylaş:
|