İlham Məmmədov, Aydın Əhmədov Nəcməddin Məmmədov



Yüklə 336 Kb.

səhifə18/87
tarix30.12.2017
ölçüsü336 Kb.
1   ...   14   15   16   17   18   19   20   21   ...   87

+  -  hüceyrə  periferiyasında  zəif sarımtıl-yaşıl  və  ya  bozum­
tul  işıq  saçma.
İm m unoferm ent  analizi.  /İFA /.  İFA-  modifikasiya  qru­
pundan  ibarət olub  buna ELİSA  üsulu /enzimə-Linked  immuno­
sorbent  assay/ aiddir.  Bu  üsulun  mahiyyəti  antigen  və  antitellə- 
rin  nişalanması  üçün  fermentlərdən  istifadə  olunmasıdır.  Bu 
üsuldan  quşların  infeksion,  şiş  və  digər xəstəliklərinin  ilk  dövr­
lərinin  diaqnosikasında,  quşçuluq  təsərüfatlarda  epizootik  və­
ziyyətin  müəyyən  edilməsində,  postvaksinal  antitellərini  sə­
viyyəsinin  təyinində,  bioloji  və  mikrobioloji  sənayenin  məhsul­
larının  keyfiyyətinə  nəzarət  edilməsində  və  s.  istifadə  edilir.
Hal-hazırda  daha  çox  İFA-nın  bərkfazalı  variantı  və  o 
cümlədən  ELİSA  tətbiq  edilir.
ELİSA-nın  aşağıdakı  şəkildəyişmələri  mövcuddur:  rəqib 
ELİSA,  «sendviç»-ELİSA  /ikiqat  antitel  üsulu/  modofıkasiyası 
«sendviç»-ELİSA,  vasitəsiz  ELİSA  və  s.
Vasitəsiz  ELİSA  o  vaxt  tətbiq  olunur  ki,  tədqiqatçı  az  miq­
darda  antitellə  üzləşir.  Bu  variantda  növəleyhinə  nişanlanmış 
antitel  götürülür.  «Sendviç »  ELİSA  metodunun  əvvəlki  metod­
dan  bir çox  üstünlüyü  mövcuddur.  Birinci  müxtəlif antigenlərin 
aşkar  edilməsi  üçün  yalnız  bir  nişanlanmış  növəleyhinə  serum- 
dan  istifadə  edilir.  İkinci,  təmizləmə  və  markirovka  təcrübəsin­
də  çoxlu  miqdarda  nadir  spesifik  serum  sərf olunmur,  halbuki 
antiqlobulinlər  həmişə  kifayət  miqdarda  olur.  Üçüncü,  ikiqat 
«sendviç»  yüksək  dərəcədə  həssaslığa  malikdir,  çünki  spesifik 
antitelin bir malekulası bir neçə malckula nişanlanmış antiqlobu- 
Iinlə  reaksiya verir,  bu da siqnalın  güclənməsinə  səbəb  olur.
Nişanlanmış antitelləri  istifadə etməklə kəmiyyət  immunoa- 
nalizlərinin  bütün  variantları  aşağıda  göstərilən  üsütnlüklərə 
malikdir. 1)  Antigen  nişanlanmır,  ona  görə  də  onun  zədələnmə- 
si  və  ya  fiziki  kimyəvi  xüsusiyyətlərinin  dəyişməsi  qeyd  olun­
mur.  2)  Antitel  molekulları  daha  çox  stabildir,  nişanlama  zama­
70
nı  o  qədər  də  zədələnm ir  və  radiozitoplarla  nişanlanan  zamanı 
radiolizə daha çox davamlılıq göstərir. 3) Çətin nişanlanan və ya 
təm iz  halda  alınması  çətin  olan  antigenləri  təyin  etmək 
mümkündür.  4)  nişanlanmış  antitellərin  çox  istifadə  edilməsi 
nəicəsində  daha çox  həssaslıq  və spesifiklik  müşahidə  edilir.
Antitellər.  Serumların  qiymətləndirilməsi  göstəriciləri  bun­
lardır:  avidlik,  spesifiklik  və  əlverişlilik  KBR-da  istifadə  edilən 
aşağı titrli  serumlar çox vaxt İFA üçün kifayət qədər spesifik ol­
mur.
Bərk  fazalı  kəmiyyət  immunitestlərində  həm  bərk  fazanın 
hazırlanması  və  həm  də nişanlanma üçün ya -  qlobulin  fraksiya­
sını  və  ya  L  q  G.yaxud  da  immunosorbsiya  nəticəsində  alınmış 
təmiz antitellər  istifadə  edilir.
Bərk  cisimlər.  Nişanlanmış  reagentlər  istifadə  edilən  kə­
miyyət  immunoloji  metodlarla  azad  və  əlaqəli  nişanlanmanın 
ayrılması  mərhələsi  çox  vacibdir ki,  bura  da ən  sadə  üsul  bərk- 
fazalı  üsul  hesab edilir.  Bərk fazalı daşıyıcılar kimi  sintetik poli- 
merlər  -   polistirol,  polipropilen,  plivinil,  dakreil  və  s.  istifadə 
edilir.
Yuvulma  mərhələləri.  ELİSA  tip  heterogen  ferment  immu- 
noanalizləri  müxtəlif reagentlərin  bir sıra  seriyasından  ibarətdir 
və  burada  ardıcıl  şəkildə  yuylma  elə  aparılmalıdır  ki,  reagentin 
bir  mərhələdən  digərinə  keçilməsi  tam  təmin  edilmiş  olsun. 
Müxtəlif borucuqlar,  planşetlər  və  s.  məhluldan  azad  edilir  və 
tərkibində  tvin-20  olan  fosfat-bufer  məhlulunun  içərisində 
müəyyən qədər saxlanır.  Üç dəfə belə ardıcıl yuyulmadan  sonra 
planşet və  digər polimer daşıyıcılarını  qurudur  və  digər reagen- 
ti  əlavə edirlər.
Nəzarət nümunələri.  Yüksək  pozitiv  nümunənin  göstəricisi­
nin  JFA  vasitəsiz  variantında  neqativ  göstəriciyə  olan  nisbəti 
5:1-ə olmalıdır.  Serum  nümunəsinin  vasitəsiz nəzarətində digər 
serum  komponentləri  ilə  reaksiya  verən  sustansiyalar  ola  bilər
71


ki,  bu  zaman  xromotoqrafıya,  sentifıquraladınna  və  ya  hər  bir 
immunoqlobulinə  spesifik  olan  adsorbentlərdən  istifadə  etm ək­
lə  1  q  M  və ya  1  q  G-nin  ayrılması  meydana  çıxır.
Fennentlər və  substar sistemləri.  Marker kimi  götürülən  fer- 
mentlər  stabil,  yüksək  reaktiv,  təmiz,  ucuz  və  tətbiqi  zamanı 
ucuz olmalıdır.
Belə  təlabatlara  peroksidaza,  qələvi  fosfataza,  asetilxolines- 
teraza,  ribonukleaza  və  s.  cavab  verir.  Permentin  seçilməsi  təb- 
qiq  olunan  materialın  xüsusiyyətlərindən  və  onun  tədqiqi 
müddətindən  asılıdır.  Eyni  vaxtda  çoxlu  miqdarda  nümunənin 
analizi  zamanı  hansı  ki,  birinci  və  sont  nümunənin  tədqiq  olun­
ma müddəti tamamilə fərqlidir ELİSA metodun xətası arta bilər. 
Belə  hallarda  daha  çox  stabil  hidrolitik  fermentləri,  yəni  qələvi 
fosfatazanı  və -  qalaktozidazanı  götürmək  lazımdır.  Nümunədə 
olan  aktivator  və  ingibitorlardan  asılı  olan  ferm entlərin 
göstürülməsi  məsləhət  bilinmir.
Substraf kimi  qələvi,  fosfataza üçün  daha  çox  nitrofenolfos- 
fat  uyğun  gəlir.  Bu  həb  şəklində  buraxılır  və  bundan  asanlıqla 
və  həmiz  halda  işçi  məhlul  hazırlamaq  mümkündür.  Peroksida- 
zanı  aşkar etmək  üçün ən yaxşı  substar  ortofenilendiamin hesab 
edilir.
Ümumiyyətlə qələvi fosfataza və -  qalaktozidaza ilə nişanlan­
mış antitellərlə birlikdə ELİSA sistemi daha dəqiq nəticələr verir.
Fermentin  zülalla  konvuqasiva  metodu.  Fermentin  antigen 
və  ya  antitellə  birləşməsi  elə  həyata  keçirilməlidir  ki,  bunların 
hər  biri  maksimal  miqdarda  öz  aktivliyini  saxlaya  bilsin.  Bu 
məqsədlə ən azı  iki olaraq aktiv qrupla birləşə bilən agent tətbiq 
olunur.  Belə  agntlərə  misal  qluitaraldehidi,  natrium-peryodenti 
göstərmək  olar.
Nəticələrin vizual  şəklində təyini o vaxt tətbiq olunur ki, bu­
rada  «hə»  və  «yox»  cavabı  verilsin.  Nəticələrin  fotometrik 
üsulla  təyini  daha  dəqiqdir.  Burada  optiki  sıxlıq  /  M  +  )  göstə­
72
riciləri  styudet  kriterisinə  müvafiq  olaraq  müəyyənləşdirilir.
ELİSA-nın  avtomatlaşdırılması  məşədilə  «Dinatec»  tipli 
aparatlardan  istifadə  edilməsi  məqsədə  müvafiqdir.
Diaqnostik  dəst preparatları  bir neçə  tipə  bölünür:
1.  Virus  antigenləri  / orqan və ya  kulturalar  )
2. 
Peroksidaza  ilə  konyuqasiya  edilmiş  növ  əleyhinə  toyuq 
immunoqlobulini
3. 
Təyin  olunan  virusa  görə  təzə  və  ya  liofilizasiya  olunmuş 
nəzarət  hiperimmun  serum.
4. 
Toyuqların  təzə  və  ya  liofilizasiya  olunmuş  nəzarət  mənfi 
serumu.
5.  Nəzarət  mənfi  antigen.
Tədqiqat  işində  PH  7,4  olan  0,01  M  fosfat-bufer  məhlulun­
dan  istifadə edilir.  Bundan  yuma məqsədilə və  indikator sistemi 
üçün  2  bufer  hazırlanır.
Yuyucu  bufer  -   tərkibində  0,5  %  tvin-80  olan  fsfat-bufer 
məhluludur.
İndikator  sistemi  üçün  bufer  tətbiq  olunmazdan  əvvəl  tünd 
şüşə  daxilində  hazırlanır.hər  40  ml  fosfat-bufer  məhluluna  40 
mq  5-aminazalisil  turşusu  100  mq  əküz  serumu  albimini  əlavə 
edilir.
Reaksiyanın  gedişi  aşağıdakı  kimi  həyata  keçirilir.
1.  Peroksidaza ilə nişanlanmış növ əleyhinə tovuq embrionu- 
nun  titrləsdirilməsi.  l:10-də  ilk  durultma  hazırlanır  və  bundan 
isə planşetin gözcükləində  1:1000 və daha çox durultma dərəcə­
ləri  fosfat  bufer məhlulu  və normal  serumu  istifadə  etməklə ha­
zırlanır.  37° S  temperaturda 2 saat müddətində  inkubasiya etdiri­
lir.  Sonra  planşetin  gözcükləri  yuyucu  buferlə  3  dəfə  yuyulur. 
Sonra  hər  durultmaya  bərabər  həcmdə  indikator  sistemi  buferi 
tökülür.  37u  S  temperaturda  30  dəqiqə  inkubasiya  edildikdən 
sonra  nəticəsi  yoxlanır.
İntensiv  palıdı  rəng  və  bunun  qara  rəngə  çevrilməsi  baş  ve­
73




Dostları ilə paylaş:
1   ...   14   15   16   17   18   19   20   21   ...   87


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2019
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə