May 1996, p. 1296-1298 Vol. 34, No

---

J

OURNAL OF

C

LINICAL

M

ICROBIOLOGY

, May 1996, p. 1296–1298

Vol. 34, No. 5

0095-1137/96/$04.00

ϩ0

Copyright

᭧ 1996, American Society for Microbiology

Antimicrobial Susceptibilities of Lactococcus lactis and

Lactococcus garvieae and a Proposed Method

To Discriminate between Them

J. A. ELLIOTT*

AND

R. R. FACKLAM

Streptococcus Reference Laboratory, Childhood and Vaccine Preventable Diseases Branch,

Division of Bacterial and Mycotic Diseases, Center for Infections Diseases,

Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia

Received 30 October 1995/Returned for modification 22 December 1995/Accepted 16 February 1996

The MICs of antimicrobial agents contained in the SCEPTOR Streptococcus MIC panels (Becton Dickinson

Microbiology Systems) were determined for Lactococcus lactis, L. garvieae, and unknown Lactococcus species.

Several isolates had reduced susceptibilities to many of the antimicrobial agents contained in the panel. For

L. garvieae, the MICs of penicillin and, possibly, cephalothin were higher than for L. lactis, and unlike L. lactis,

L. garvieae was resistant to clindamycin, indicating that knowledge of the Lactococcus species causing an

infection might influence the choice of antimicrobial therapy. Susceptibility to clindamycin can also be used to

differentiate between L. lactis and L. garvieae.

Lactococcus spp. have only recently been reported to cause

infections in humans (5, 15, 23). The clinical information in

these reports indicates that these bacteria cause a variety of

different types of infections similar to the types caused by

enterococci. In fact, before lactococci were recognized as hu-

man pathogens, we often identified them as variants of estab-

lished Enterococcus spp., including Enterococcus faecium, E.

faecalis, E. durans, and E. hirae. There are seven recognized

Lactococcus species and subspecies that can be identified by

physiologic reactions (4, 7–10, 12, 21). The majority of human

source isolates that we have received have been either Lacto-

coccus lactis subsp. lactis or L. garvieae (5).

Distinguishing between these two species solely on the basis

of their physiologic characteristics is very difficult. We have

used molecular tests such as whole-cell protein analysis (5, 7)

and DNA or RNA analysis (1–3, 13, 14, 17–20, 22) to help in

the identification of recent isolates. The value of molecular

techniques for the differentiation between L. lactis and L.

garvieae is demonstrated by our reevaluation of isolates that we

had previously identified by substrate utilization only. Molec-

ular results indicated that some of the isolates we had classified

as L. lactis were actually L. garvieae and that a few that were

identified as L. lactis were L. garvieae (5, 9).

The importance of confirming the identification of L. lactis

and L. garvieae by doing expensive and labor-intensive molec-

ular tests in a clinical microbiology laboratory is unknown. No

information is available about possible differences in antimi-

crobial susceptibility between these species. Such differences

might have an impact on disease therapy and would justify

additional effort in species identification. In this study, we

tested the antimicrobial susceptibilities of L. lactis and L. gar-

vieae to determine if there are differences in antimicrobial

susceptibility between these species.

Six isolates of L. lactis and 13 of L. garvieae, all from humans,

were recovered from the culture collection at the Centers for

Disease Control and Prevention. This is a small group of bac-

teria because of the rarity of infections caused by these bacte-

ria, but their identity is without question, which makes this

group more significant. Species identity was confirmed by mo-

lecular techniques that included whole-cell protein analysis

and DNA and RNA analysis. The type strains for L. lactis

(ATCC 19435) and L. garvieae (ATCC 43921) were also con-

firmed by molecular techniques and included in our tests. Nine

isolates that are presumed to be lactococci but could not be

assigned to a species were also tested.

Antimicrobial susceptibility testing was done by a broth di-

lution procedure. Bacteria were grown on Tryticase soy

agar–5% sheep blood plates (Becton Dickinson Microbiology

Systems, Cockeysville, Md.) for 18 h and suspended in Muel-

ler-Hinton broth to an optical density equivalent to a 0.5 Mc-

Farland turbidity standard. Ten microliters of this suspension

was inoculated into 10 ml of cation-adjusted Mueller-Hinton

broth supplemented with 5% lysed horse blood (16). SCEP-

TOR Streptococcus MIC panels (Becton Dickinson Microbi-

ology Systems) were inoculated by using the automated BD

SCEPTOR preparation station. MIC panels were incubated

for 18 h at 37

ЊC in a CO

2

incubator. Growth was read visually,

and the MIC was defined as the lowest concentration of a drug

that inhibited growth. E. faecalis (ATCC 29212 and ATCC

51299), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), and Escherichia

coli (ATCC 35218) were included as controls (16).

The MICs are listed in Table 1. All MICs for the control

bacteria were within the ranges specified by the National Com-

mittee for Clinical Laboratory Standards (16). In addition to

being resistant to clindamycin, L. garvieae appeared to be

somewhat less susceptible to penicillin and cephalothin than

did L. lactis. For some members of both species, the MICs of

several other antimicrobial agents in the panel, including

amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, and norfloxacin, were

higher than those for members of the same species. One of the

unknown Lactococcus spp. had susceptibility results similar to

those of L. garvieae, and eight had results similar to those of L.

lactis.

L. lactis and L. garvieae differed in susceptibility to clinda-

mycin. L. garvieae was always more resistant to clindamycin

* Corresponding author. Mailing address: Childhood and Vaccine

Preventable Diseases Branch, Centers for Disease Control and Pre-

vention, Atlanta, GA 30333. Phone: [phone]. Fax: (404) 639-

3123.

1296

 on January 16, 2018 by guest

http://jcm.asm.org/

Downloaded from 

---

(MIC,

Ն2 ␮g/ml) than was L. lactis, and L. lactis was always

susceptible (MIC,

Յ0.12 ␮g/ml). We used this information to

determine if the two species could be differentiated by a Kirby-

Bauer-like test using clindamycin disks. The test was similar to

the vancomycin disk procedure that is used to identify Leu-

conostoc and Pediococcus spp. (6).

Several colonies of bacteria were spread on a Tryticase soy

agar–5% sheep blood plate, and a clindamycin disk (2

␮g) was

added to the plate. The diameter of the growth inhibition zone

was measured after 24 h of incubation at 37

ЊC in a CO

2

incu-

bator.

All of the bacteria that we confirmed as L. lactis had zones

of inhibition around the clindamycin disk of

Ն20 mm (average,

24 mm). All of the L. garvieae isolates had no zones of inhibi-

tion. The unknown lactococci that were susceptible to clinda-

mycin (eight isolates) by MIC determination had zones of

inhibition that were similar to that of L. lactis. The other

unknown lactococci had zones of inhibition similar to that of L.

garvieae. We have incorporated the clindamycin disk test in our

identification procedures to differentiate between L. lactis and

L. garvieae.

Our results indicate that there are differences in antimicro-

bial susceptibility between L. lactis and L. garvieae. These dif-

ferences may have an impact on the choice of antimicrobial

therapy, especially if clindamycin is being considered. For both

species, and other human isolates of unidentified lactococci,

the MICs of several of the antimicrobial agents included in the

SCEPTOR Streptococcus MIC panel are higher, but these

organisms are as susceptible to these antimicrobial agents as

are the enterococci (16, 24), the group of bacteria most often

confused with lactococci. Resistance to vancomycin was not

observed in this group of lactococci. Although previous inves-

tigators have reported that vancomycin resistance does occur

in lactococci (11), subsequent reevaluation of the identity of

these bacteria at the Centers for Disease Control and Preven-

tion revealed that they were not Lactococcus species but Pe-

diococcus species. Vancomycin resistance, therefore, has yet to

be found in bacteria that can be confirmed as Lactococcus

species.

The antimicrobial susceptibility results support the impor-

tance of differentiating between L. lactis and L. garvieae. Dif-

ferentiation between these species can be simplified by incor-

porating sensitivity to clindamycin into an identification

scheme. This test must be limited to differentiation between L.

lactis and L. garvieae, since nearly all of the unknown Lacto-

coccus isolates had clindamycin susceptibilities that were sim-

ilar to that of L. lactis and one unknown isolate had a suscep-

tibility similar to that of L. garvieae. However, if the physiologic

reactions indicate that the isolate is either L. lactis or L. gar-

vieae, a clindamycin disk test result or the MIC of clindamycin

can be used to differentiate between these two species.

We thank M. D. Collins, Agricultural and Food Research Council,

Reading Laboratory (Shinfield, Reading, United Kingdom), for the

RNA and DNA results.

REFERENCES

1. BeimfohR, C., A. Krause, R. Amann, W. Ludwig, and K. H. Schleifer. 1993.

In situ identification of lactococci, enterococci and streptococci. Syst. Appl.

Microbiol. 16:450–456.

2. Betzl, D., W. Ludwig, and K. H. Schleifer. 1990. Identification of lactococci

and enterococci by colony hybridization with 23S rRNA-targeted oligonu-

cleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 56:2927–2929.

3. Cancilla, M. R., I. B. Powell, A. J. Hillier, and B. E. Davidson. 1992. Rapid

genomic fingerprinting of Lactococcus lactis strains by arbitrarily primed

polymerase chain reaction with

32

P and fluorescent labels. Appl. Environ.

Microbiol. 58:1772–1775.

4. Collins, M. D., J. A. E. Farrow, B. A. Phillips, and O. Kandler. 1983.

Streptococcus garvieae sp. nov. and Streptococcus plantarum sp. nov. J. Gen.

Microbiol. 129:3427–3431.

5. Elliott, J. A., M. D. Collins, N. E. Pigott, and R. R. Facklam. 1991. Differ-

entiation of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae from humans by

comparison of whole-cell protein patterns. J. Clin. Microbiol. 29:2731–

2734.

6. Facklam, R. R., and J. A. Washington III. 1991. Streptococcus and related

catalase-negative gram-positive cocci, p. 238–257. In A. Balows, W. J. Hau-

sler, Jr., K. L. Herrmann, H. D. Isenberg, and H. J. Shadomy (ed.), Manual

of clinical microbiology, 5th ed. American Society for Microbiology, Wash-

ington, D.C.

7. Garver, K. I., and P. M. Muriana. 1993. Detection, identification and char-

acterization of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from retail food

products. Int. J. Food Microbiol. 19:241–258.

8. Garvie, E. I. 1978. Streptococcus raffinolactis (Orla-Jensen and Hansen):

a group N streptococcus found in raw milk. Int. J. Syst. Bacteriol. 28:190–

193.

9. Garvie, E. I., and J. A. E. Farrow. 1982. Streptococcus lactis subsp. cremoris

(Orla-Jensen) comb. nov. and Streptococcus lactis subsp. diacetilactis (Ma-

tuszewski et al.) nom. rev., comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 32:453–455.

10. Garvie, E. I., J. A. E. Farrow, and B. A. Phillips. 1981. A taxonomic study of

some strains of streptococci that grow at 10

ЊC but not at 45ЊC, including

Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris. Zentralbl. Bakteriol. Para-

sitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe C 2:151–165.

11. Green, M., R. M. Wadowsky, and K. Barbadora. 1990. Recovery of vanco-

mycin-resistant gram-positive cocci from children. J. Clin. Microbiol. 28:484–

488.

12. Hashimoto, H., H. Kawakami, K. Tomokane, Z. Yoshii, G. Hahn, and A.

Tolle.

1979. Isolation and characterization of motile group N streptococci. J.

Fac. Appl. Biol. Sci. Hiroshima Univ. 18:207–216.

13. Klijn, N., A. H. Weerkamp, and W. M. de Vos. 1991. Identification of

mesophilic lactic acid bacteria by using polymerase chain reaction-amplified

variable regions of 16S rRNA and specific DNA probes. Appl. Environ.

Microbiol. 57:3390–3393.

14. Ko

¨hler, G., W. Ludwig, and K. H. Schleifer.

1991. Differentiation of lacto-

cocci by rRNA gene restriction analysis. FEMS Microbiol. Lett. 84:307–312.

15. Mannion, P. T., and M. M. Rothburn. 1990. Diagnosis of bacterial endocar-

ditis caused by Streptococcus lactis and assisted by immunoblotting of serum

antibodies. J. Infect. 21:317–326.

16. National Committee for Clinical Microbiology Standards. 1993. Methods

for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobi-

cally. Approved standard M7-A3. National Committee for Clinical Labora-

tory Standards, Villanova, Pa.

17. Nzouzi, N. L., M. F. Guerin, and D. H. Hayes. 1992. Comparison of elec-

trophoretic distribution patterns of ribosomal RNA gene restriction frag-

ments and of ribosomal subunit proteins of lactococci, streptococci, and

pediococci. Biochimie 74:1007–1017.

18. Ramos, M. S., and S. K. Harlander. 1990. DNA fingerprinting of lactococci

and streptococci used in dairy fermentations. Appl. Microbiol. Biotechnol.

34:

368–374.

19. Rodrigues, U. M., M. Aguirre, R. R. Facklam, and M. D. Collins. 1991.

Specific and intraspecific molecular typing of lactococci based on polymor-

phism of DNA encoding rRNA. J. Appl. Bacteriol. 71:509–516.

20. Salama, M., W. Sandine, and S. Giovannoni. 1991. Development and appli-

TABLE 1. Antimicrobial susceptibilities of L. lactis and L. garvieae

Antimicrobial agent(s)

MIC range (

␮g/ml) for strains of:

L. lactis

L. garvieae

Vancomycin

Յ1.0

Յ1.0

Amoxicillin-clavulanic acid

Յ0.12/0.06–1.0/0.48 0.48/0.24–1.0/0.48

Ampicillin

Յ0.12–0.24

0.48

Penicillin

0.12–0.24

1.0

a

Chloramphenicol

2.0–4.0

2.0–4.0

Clindamycin

Յ0.12

Ն8.0

b

Erythromycin

Յ0.12

Յ0.12

Cephalothin

Յ1.0–4.0

4.0–8.0

Cefuroxime

Յ4.0

Յ4.0

Ciprofloxacin

Յ1.0–4.0

Յ1.0–2

Norfloxacin

Յ4.0–16.0

Յ4.0–16.0

Trimethoprim-sulfamethoxazole

Յ1.0/19

Յ1.0/19

Tetracycline

Յ2.0

Յ2.0–Ն8.0

a

One isolate required an MIC of penicillin of 0.24

␮g/ml.

b

One isolate required an MIC of clindamycin of

Ն2.0 ␮g/ml.

V

OL

. 34, 1996

NOTES

1297

 on January 16, 2018 by guest

http://jcm.asm.org/

Downloaded from 

---

cation of oligonucleotide probes for identification of Lactococcus lactis,

subsp. cremoris. Appl. Environ. Microbiol. 57:1313–1318.

21. Schleifer, K. H., J. Kraus, C. Dvorak, R. Kilpper-Ba

¨lz, M. D. Collins, and W.

Fischer.

1985. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the

genus Lactococcus gen. nov. Syst. Appl. Microbiol. 6:183–195.

22. Tanskanen, E. I., D. L. Tulloch, A. J. Hillier, and B. E. Davidson. 1990.

Pulsed-field gel electrophoresis of SmaI digests of lactococcal genomic

DNA, a novel method of strain identification. Appl. Environ. Microbiol.

56:

3105–3111.

23. Wood, H. F., K. Jacobs, and M. McCarty. 1985. Streptococcus lactis isolated

from a patient with subacute bacterial endocarditis. Am. J. Med. 18:345–347.

24. Yamane, N., and R. N. Jones. 1991. In vitro activity of 43 antimicrobial

agents tested against ampicillin-resistant enterococci and gram-positive spe-

cies resistant to vancomycin. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 14:337–345.

1298

NOTES

J. C

LIN

. M

ICROBIOL

.

 on January 16, 2018 by guest

http://jcm.asm.org/

Downloaded from