Mbg-biyokimya 2 Yrd. Doç. Dr. Bünyamin Özgeriş Arş. Gör. Ebru Öztaş Deney 1: İnce tabaka ve kağit kromotografiSİ



Yüklə 19,04 Kb.
tarix30.12.2017
ölçüsü19,04 Kb.

MBG-BİYOKİMYA 2

Yrd.Doç.Dr.Bünyamin Özgeriş

Arş.Gör.Ebru Öztaş

Deney 1:

İNCE TABAKA VE KAĞIT KROMOTOGRAFİSİ

Fotosentetik pigmentler ışık enerjisini absorblayan ve onu kimyasal enerjiye dönüşmesi için uygun hale getiren yapılardır. Fotosentez sırasında bitkilerde bulunan pigmentler ışık enerjisini yakalarlar. Yeşil bitkilerde bulunan 4 temel pigment ince tabaka ve kağıt kromatagrafisi yöntemi ile kolayca ayrıştırılıp tanımlanabilir. Bu pigmentler farklı çözünürlüklere sahiptir ve bu sayede plakalar üzerinde farklı hızlarda yürüyeceklerdir.

4 temel pigment:


chromatograph

Şekil : Fotosentetik pigmentlerin ince tabaka kromatgrafi ile ayrıştırılması

İnce Tabaka Kromatografisi

Kromatografi Bir karışımda bulunan maddelerin iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması işlemidir. Maddelerin hareketli faz yardımıyla sabit faz üzerinde değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır.

İnce tabaka kromatografisinde hareketli faz sıvı, sabit faz ise katıdır. Hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyişi aşağıdan yukarıya doğru olur.Çözücü kılcallık etkisi ile içine daldırılan ince tabaka plaka üzerinde yürür.Bu işlem sırasında plakanın alt kısmına damlatılan karışımı da farklı hızlarla yukarıya sürükler. Ayrım bu şekilde sağlanmış olur. Yürüme hızı maddenin, katı fazın ve çözücünün polaritesine bağlıdır. .Pigmentlerin ekstraksiyonu

Materyaller:

Ispanak


Aseton

Havan


Santrifüj

Sıcak Su Banyosu



Metot:

  1. Bitkilerin yeşil yapraklarından 10 g tartılır ve bir havanda 5 ml aseton içerisinde iyice ezilir.

  2. Elde edilen pigment ekstraktı 300-400 g’de 5 dk santrifüj edilir.

  3. Süpernatant temiz bir tüpe aktarılıp su banyosunda bekletilir. Bu sayede asetonun fazlası uçurulmuş olur.

Pigmentlerin kromatografi yöntemiyle ayrıştırılması

Materyaller:

TLC plakaları

Kurşun kalem

Pasteur Pipeti

Metanol:Etanol:Aseton (3:1:1) toluen/etanol

Metot:


  1. TLC plakalarının alt kısmından 1.5 cm olacak şekilde kurşun kalemle işaretlenir ve bir çizgi çekilir.

  2. Bu çizgi üzerine pigment ekstraktından pasteur pipeti ile 5-6 damla damlatılır.

  3. Behere 1 cm yüksekliğinde toluen/etanol solventinden konularak ağzı alüminyum folyo ile kapatılır.

  4. Ekstrakt damlatılan plakalar işaretli kısım aşağıya gelecek şekilde behere yerleştirilir..

  5. Solvent yukarıdan 2 cm yüksekliğe ulaştığında plakalar beherden çıkarılır ve pigmentlerin yerleri ile solventin en son vardığı yer işaretlenir.

  6. Rf değerleri hesaplanır ve pigmentler tanımlanır.

KAĞIT KROMATOGRAFİSİ

Uygulaması en basit ve en çok kullanılan yöntemlerden biri olan kağıt kromatografisi genellikle süzgeç kağıtları kullanılarak yapılır.. Burada etkin mekanizma dağılmadır. Çünkü dağılma kromatografisindeki sabit fazın yerini burada özel olarak yapılmış olan İngiliz Whatman,Alman Schleicher ve Schull v.b gibi markalardan oluşan bir süzgeç kağıdı almaktadır. Süzgeç kağıdı suyu çok kolay ve kuvvetle adsorbladığından yapılarında doğal olarak bir miktar su içerir ve sabit sıvı faz rolünü oynar. Kağıda uygulanan maddeler karışımının birbirlerinden ayrılmaları, kağıt üzerinde hareket eden çözücüyle kağıdın içerdiği su arasındaki dağılma farkına bağlıdır.

Analizi yapılacak madde çözelti halinde olmalı ve katılar uygun bir çözücüde çözünmelidir. Çözeltiler belli bir konsantrasyonda olmalıdır, en az %1’lik çözelti kullanılmalıdır.

Kağıt kromatografisinde analiz şöyle yapılır:

Analizi yapılacak madde çözeltisinden ince cam kapiler ile bir miktar alınıp, istenilen ebatta kesilen whatman yada diğer marka kromatografi kağıdının altından küçük lekeler halinde damlatılır. Kağıda hareketli fazın ilerleme sınırı işaretlenir. Hareketli faz çözücüsü karışımdaki maddelerin yapısına ve tecrübelere dayanılarak seçilir. Kağıt çözücüyü emer ve çözücü kağıt üzerinde ilerlerken lekenin içerdiği farklı bileşikleri farklı yerlere kadar taşır. Maddeler renkliyse, lekeler kolaylıkla görülür. Renksiz bileşikler görülemeyeceği için karışımdaki bileşiklerle renk verecek özel ayıraçlar kağıda bir spreyle püskürtülür veya U.V. lambası altında bakılır.

Ayrılan maddeler görülür hale getirildikten sonra çözücü yardımıyla madde içerisindeki farklı bileşiklerin belli noktalara ilerlediği gözlenir. Her maddenin hareketli faz ile sürüklenmeleri farklıdır. Böylece her madde için uygulanan koşullar belirtilerek karakteristik değerler verilebilir. Buna sürüklenme derecesi veya alıkonma faktörü denir ve Rf ile gösterilir.

Rf = Maddenin ilerlediği uzaklık(cm) / Çözücünün ilerlediği uzaklık(cm) = a / b

Rf bir madde için aynı sabit faz ve aynı çözücü için sabittir. Önceden belirlenen Rf değerleri ile bilinmeyen çözelti içerisinde hangi maddelerin bulunduğu belirlenebilir.



KAĞIT KROMATOGRAFİSİ

Boya Karışımlarının Ayrılması

Madde malzeme

Kromatografi tankı

Kapiler cam boru

kırmızı renkli boya çözeltisi

Mor renkli boya çözeltisi

Yeşil renkli boya çözeltisi

Cetvel

%7lik etil alkol



4x8cm boyutunda Whatman marka kromatografi kağıdı



İşlem

1.4x8cm boyutundaki whatman marka kromatografi kağıdının altından 1cm yükseklik cetvelle ölçülerek kağıdın bir kenarından diğer kenarına parelel bir çizgi kurşun kalemle hafifçe çizilir.Çizginin üzerine uygulanacak 3 boyanın yerleri 1cm aralıkla kurşun kalemle işaretlenir.

2.İşaretlenen yerlere kırmızı mor ve yeşil boyalar ayrı kapilerler yardımıyla uygulanır. Uygulanan örneklerin çapı 5mm yi geçmemelidir.

3.Kromatografi tankına yaklaşık 0.5-0.7cm yüksekliğe kadar %7 lik Etil alkol çözeltisi koyulur. Kapağı kapatılarak 5dk. beklenir. Tank çözeltiyle doymuş hale gelmelidir.

4.5dk.sonunda kromatografi kağıdı şekildeki gibi tanka koyulur. Çözücü karışımının kağıt üzerinde yukarıya doğru ilerlemesi ile boya karışımları içerisindeki renklerin yavaş yavaş birbirinden ayrılması gözlenir. Kromatografi kağıdının üst kısmından yaklaşık 1 cm kalıncaya kadar çözücünün ilerlemesi beklenir.

5. Kağıt tanktan çıkarılır. Çözücünün ilerleme sınırı kağıdın bir kenarından diğer kenarına kurşun kalemle çizilerek işaretlenir ve kurumaya bırakılır.

6. renkli karışımlardan ayrılan renkler tek tek veri olarak kaydedildikden sonra her rengin sürüklenme derecesi(Rf) formülünden hesaplanarak verilere kayıt edilir(Renkli lekelerin yerleri cetvelle ölçülürken lekenin orta noktası baz alınır.).

Rf Değeri :

Yürüme hızı, Rf değeri ile ifade edilir ve substansın yürüme mesafesinin, çözücünün yürüme mesafesine oranından hesaplanır. Rf değeri 0 ile 1 arasında bulunur ve doğal olarak hızlı yürüyen komponentler için alınan mesafe büyük olacağından Rf değeri büyük, daha yavaş yürüyenler için daha küçüktür.

Bileşiğin uygulama noktasından itibaren aldığı yol

Rf =


Çözücünün orijinden itibaren aldığı yol






Dostları ilə paylaş:


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2019
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə