Negatif boyama

NEGATİF BOYAMA

NEGATİF BOYAMA

Mikroorganizmaların büyüklüğünü ve şeklini daha iyi görmek için uygulanan boyama tekniğidir. İndirek boyama yöntemidir. Bu boyama yönteminde mikroorganizmalar değil zemin boyanır. Nigrosin veya eosin gibi asidik boyalar kullanılır. Boyanmış zemin üzerinde mikroorganizmalar açık olarak görülür. Negatif boyamda ısı ile fiksasyon işlemi yoktur, bu nedenle hücreler sarar görmez. Böylece doğal şekilleri ve büyüklükleri kolayca incelenebilir. Yine bu yöntemle boyanması güç olan bakterilerin incelenmesi mümkündür.

AMAÇ

Negatif boyama yöntemi kullanılarak mikroorganizmaların morfolojilerini incelemek

MATERYAL

1. 
   Kültürler: Mikroorganizma kültürleri (18-24 saatlik)
   

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Streptococcus feacelis

Bacillus cereus

2. 
   Boyalar: Nigrosin veya eosin boya çözeltisi., Çini mürekkebi
   

3. 
   Araç ve gereçler: Mikroskop, lam, Bunzen beki, öze, kurutma kağıdı, ksilol.
   

İŞLEM

1. 
   Temiz bir lamın bir tarafına bir damla nigrosin boya çözeltisinden koyunuz.
   
2. 
   Bir öze dolusu mikroorganizma süspansyonu alarak boya ile iyice karıştırınız.
   
3. 
   Karışımı diğer bir lamın kenarı ile üniform olacak şekilde dikkkatlice yayınız.
   
4. 
   Preparatı kurumaya bırakınız.
   
5. 
   İmmersiyon objektifi ile preparatı inceleyiniz.
   

GÖZLEM SONUÇLAR

1. 
   Her bir mikroorganizma için görünüş şekillerini çiziniz.
   
2. 
   Farklı bakterilerin mikroskobik görünüşlerini tanımlayınız.
   

KONU İLE İLGİLİ SORULAR

1. 
   Negatif boyama ile diğer boyama tekniği arasındaki fark nedir?
   
2. 
   Bu boyama tekniğine niçin negatif boyama adı verilmektedir?
   
3. 
   Negatif boyama için nigrosin yerine metilen mavisi kullanılabilir mi? Açıklayınız.
   

GRAM BOYAMA

GRAM BOYAMA

Gram boyama diferansiyel boyama tekniğidir. Bu boyama tekniğinde 4 farklı kimyasal reagent kullanılır. İlk boya ile hücre tamamen boyanır. Daha sonra dekolorize edici madde kullanıldığında bir kısım hücreler rengini verirken bir kısmı da rengini korur. Daha sonra birinci boyaya karşıt bir boya kullanılır. İlk boyanın rengin koruyan hücreler ikinci boyayı absorbe edemez ve mor menekşe renginde görülürler. İkinci boyayı alan hücreler ise kırmızı renkli görülürler. İkinci boyayı alan hücreler ise kırmızı renkli görülürler. Burada Gram’ın iyot çözeltisi mordan olarak iş görmektedir. Alkol ise dekolorize edicidir.

Gram negatif bakteriler kristal viyole rengini kaybederek, ikinci boya olan safraninin rengini alıp kırmızı renkli görülürler. Gram pozitif bakteriler ise kristal viyolenin rengini alır ve mor menekşe renkli görülürler.
AMAÇ

Bakterileri Gram pozitif ve Gram negatif olarak iki gruba ayırmak.

MATERYAL

1. 
   Kültürler: Mikroorganizma kültürleri (18-24 saatlik)
   

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Bacillus cereus

2. 
   Boyalar: Kristal viyole ve karbol fuksin boya çözeltisi, Gram’ın iyot çözeltisi, %96’lık alkol.
   

3. 
   Araç ve gereçler: Mikroskop, lam, Bunzen beki, öze, kurutma kağıdı, ksilol, sedir yağı.
   

İŞLEM

1. 
   18-24 saatlik kültürden lam üzerine alınız ve usulüne uygun preparat hazırlayınız.
   
2. 
   Preparatın üzerine kristal viyole boya çözeltisini dökünüz ve 1-1.5 dakika bekleyiniz.
   
3. 
   Boyayı dökerek su ile yıkayınız.
   
4. 
   Bu sürenin sonunda boyayı dökünüz ve preparatın üzerine Gramın iyot çözeltisinden dökerek 1 dakika bekleyiniz.
   
5. 
   Bu sürenin sonunda Gramın iyot çözeltisini dökünüz ve preparatı su ile yıkayınız.
   
6. 
   Bundan sonra lamı %96’lık alkole batıp çıkararak 10-15 saniye alkol ile yıkayınız.
   
7. 
   Lamı musluk sulu ile yıkayınız.
   
8. 
   Lamın üzerine karbol fuksin boya çözeltisinden dökerek 20 saniye tutunuz.
   
9. 
   Bu sürenin sonunda lamı su ile yıkayarak kurutunuz.
   
10. 
    Boyanan preparatları mikroskopta en az büyüten objektif ve immersiyon objektifi ile kontrol ederek değerlendiriniz.
    

GÖZLEM SONUÇLAR

1. 
   Her mikroorganizma için gözlemlerinizi kayediniz.
   
2. 
   Görüntü alanının çeşitli yerlerindeki hücrelerin tek veya küme halindeki şekillerinin her mikroorganizma için ayrı ayrı şeklini çiziniz.
   

KONU İLE İLGİLİ SORULAR

1. 
   Gram pozitif bakterilerde niçin kristal viyole tutulmaktadır?
   
2. 
   Gram boyamanın mekanizmasını açıklayınız?
   
3. 
   Boyamada kullanılan kimyasal reaktifler hangi amaçla kullanılmaktadır?