Népegészségügyi genomika Tartalom


Az új DNS-szál mindig 5'-3' irányban szintetizálódik



Yüklə 0,5 Mb.
səhifə2/7
tarix17.01.2018
ölçüsü0,5 Mb.
#21280
1   2   3   4   5   6   7

Az új DNS-szál mindig 5'-3' irányban szintetizálódik.

templát szál: meghatározza a komplemeter DNS szekvenciát

primer: meghatározza a DNS szintézis kezdőpontját

DNS polimerázok, nukleotidok: dATP, dCTP, dGTP, dTG

vezető szál : szintézise:  a két DNS-szál  ellentétes irányultságú, az egyik új szál szintézisének az iránya megegyezik a replikáció (a két szál szétnyitásának) irányával.

követő szál : szakaszosan épül fel, az újabb templát szálak szabaddá válását követően.

Mindkét új szál szintézise azonos irányban halad a villa nyitásával. A követő szál templátja hurkot képez a komplexen belül, hogy ez megvalósulhasson.



Okazaki fragment: követő szál kis szakaszokban történő szintézise 1000-2000 bázispár hosszúságúak.

Helikázok és topoizomerázok

4.2.2. A DNS replikáció lépései



  • Replikáció iniciáció (indítás)

  • helkáz, topoizomeráz

  • A replikációs villa kialakulása, replikációs buborék

  • Elongáció (a szál szintézise, hosszabbodása)

  • Termináció (a replikáció befejezése)

  • A termék(ek)

4.2.3. A genetikai kód megfejtése: bázissorrendek megismerése

  • Milyen transzlációs szabályok szerint állnak elő a polipepdik szekvenciák?

  • Hogyan határozza meg a DNS nukleotid sorrendje az adott ponton beépülő aminosavat?

  • Melyik a 20 közül? A DNS-ben csak 4 bázis van!!!

  • Legalább 3 nukleotidra van szükség

  • (permutaciók száma 64: 4x4x4)

  • 4 nukleotid redundáns

Brenner és Crick: kísérlet, mutációk, bázishármasok egyetlen bázispár hiba súlyos következmények: KERETELTOLÓDÁS, hibás fehérje.

5. Transzkripció

5.1. Transzkripció


  • egy adott kódrendszer elemeinek egy másik kódrendszerbe történő átkódolása

  • Az RNS-molekulák szintézisét az RNS-polimerázok katalizálják

  • Az RNS-szintézis mechanizmusa hasonlít a DNS-replikáció mechanizmusához

  • Promóter: DNS templát azon helye, ahol az átírás megkezdődik

  • Terminátor: ahol befejeződik

  • RNS-polimeráz enzim „leolvassa” a DNS-t felépítő nukleotidok sorrendjét, nukleozidokat épít be az RNS-lánc

  • Az RNS bázisai a DNS-bázisaival ideiglenes hidrogén-kötéseket képesek létesíteni (adenin-uracillal, guanin -citozinnal).

Az RNS-polimeráz: nincs nukleáz (nukleinsav bontó) aktivitása, így képtelen kijavítani a hibásan bekötött nukleotidokat. A hibás átírás a transzkripció esetében csak az aktuálisan képződő fehérjemolekulát teszi nagy valószínűséggel működésképtelenné a folyamat a következő átíráskor helyreáll. RNS-polimeráz nem igényel primert.

5.2. A transzkripció lépései



1. iniciáció

  • RNS polimeráz promóterhez kapcsolódik

  • transzkripciós startpont

  • az első átírásra kerülő bázispár

  • alfa hélix szétválik

  • kódoló ~értelmes szál ~szensz szál

  • templát ~ antiszensz

2. elongáció ~láncépítés

  • RNS polimeráz

  • átírásra kerül

  • exon

  • fehérjét kódoló régió

  • intron

  • fehérjét nem kódoló régió

3. tertermináció

RNS termék, RNS polimeráz felszabadul, DNS visszanyeri duplahelikális szerkezetét

5.3. RNS típusai


  • mRNS (~hírvivő ~messenger)

információátvitel -> minden mRNS egy gén, egy polipeptidlánckodon: információk tárolása, minden bázis hármas egy meghatározott aminosavat kódol. START és STOP jelek.

Ugyanazok a bázishármasok ugyanazokat az aminosavakat kódolják minden élőlényben.  

A kód degenerált, azaz egy aminosavat több bázishármas is kódolhat.


  • rRNS

riboszómák struktuális eleme

citoplazma endoplazmatikus retikulum (ER)



  • tRNS (~szállító ~transfer)

3’ vége aminosavat köt

5’ vége bázishármast tartalmaz

antikodon

mRNS kodonját ismeri fel

egyedi térszerkezet

5.4. Transzláció : RNS - > fehérje



Transzláció:

  • aminosavak összefűzése polipeptidlánccá

  • bonyolult térszerkezetű fehérjemolekulák

  • emberi szervezet 10 000 szerkezetű és funkciójú fehérje

  • helye citoplazma endoplazmatikus retikulum riboszómák felszíne ~poliszómák

Transzláció feltétele:

  • aminosav tRNS-hez kapcsolása

  • aminósav tRNS szintézis

- specificitása kulcsfontosságú a pontosság szempontjából

- 20-féle aminosav - > 20-féle szintetáz

- korrekciós funkció

5.5. Transzláció lépései



1. iniciáció

  • riboszómák kis alegységéhez tRNS kapcsolódik

  • mRNS cap struktúra felismerése

  • iniciáció beindítása:

- AUG kodon keresése

- CCG purin bázis CCAUGG



  • nagyobb alegység kapcsolása

2. elongáció

  • szabad A kötőhelyre a következő kodonnak megfelelő aminosav-tRNS

  • peptidkötés

- peptidil transzferáz

  • transzlokáció

-   riboszóma egy triplettel továbblép a riboszómán

  • töltetlen tRNS távozik P kötőhelyről

  • peptidil-tRNS átkerül P kötőhelyre

  • újabb aminosav-tRNS megkötése

3. termináció

  • A kötőhelyre terminációs kodon UAG, UAA, UGA

  • terminációs faktorok aktiválása

- elkészült polipeptid lánc felszabadul

-     mRNS disszociál a riboszómáról



Poszttranszlációs módosítás: az aminosav oldalláncok utólagos módosítása (pl. foszforilálás, hidroxilálás, szulfonálás, glikozilálás stb.)

6. Génexprsszió

6.1. Mi az oka annak, hogy egyes gének aktívak, mások pedig inaktívak?

Az emberi szervezet valamennyi sejtje ugyanazt a kromoszóma készletet tartalmazza mégis a specifikus szövetekben a géneknek csak kis hányada expresszálódik, a szövetek különböző fehérjéket tartalmaznak. Például az a gén, melyik a keratin fehérjét kódolja aktív a bőrsejtekben, de ugyanakkor nem fejeződik ki az agysejtekben.

Mi határozza meg, hogy az egyes szövetek melyik gént expresszálják, melyik aktiválódik? A génexpresszió (génkifejeződés) szabályozásának legfontosabb szintje a transzkripció. Minél nagyobb méretű a genom a szabályozás annál összetettebb a számos biokémiai folyamat működésének szabályozása, összehangolása miatt. Ugyancsak nagyobb a környezetből érkező különböző jelek száma, ami igen bonyolult kölcsönhatási rendszereket igényel. A szövetek specifikus működéséhez, a differenciáció egyes lépéseihez meghatározott génkészlet szükséges. A gének kifejeződésének szabályozása, melynek során figyelemmel kell lenni a pillanatnyi környezeti hatásokra is, több szinten nyilvánul meg.

A génkifejeződés a DNS-RNS-fehérje útvonal bármely szintjén szabályozható és befolyásolható. Fontos szerepet játszik a kromatinszerkezet (szokták durvább szintű szabályozásnak is nevezni), abban az értelemben, hogy a kromatinszerkezet kondenzáltsága határozza meg, hogy melyek azok a gének, amelyek hozzáférhetőek az RNS- polimeráz számára és melyek nem. A kromatinkondenzáció mellett a hisztonok modifikálása is szabályozó hatással bír, mivel a hiszton acetiláció elősegíti, a dezacetiláció gátolja az adott DNS- szekvencia átírását. A génexpresszió finom szintű szabályozását szabályozó elemek (un. cisz-elemek) és a velük kölcsönhatásban lévő transzkripciós faktorok (un. transz elemek) irányítják. A transzkripciós faktorok képesek felismerni és hozzákötődni a DNS meghatározott szakaszaihoz, ezáltal befolyásolni az RNS átírását. A cisz-elemek sokszor több 100 vagy akár 1000 kb távolságra helyezkednek el a géntől, ellentétben a promóter szekvenciától, mely a génátírást iniciálja. A promóterek a közvetlenül a gének előtt elhelyezkedő DNS szakaszok és a transzkripcióban rendkívül fontos szerepet töltenek be. Funkciójukat tekintve meghatározzák az adott gén átírásának helyét, irányát és gyakoriságát. A promoterek deléciókat és pontmutációkat tartalmazó változatokkal („up és down” mutációk) fokozzák vagy gyengítik a génátírást.

6.2. A transzkripció szövetspecifikus szabályozása

A cisz DNS elemek, melyek ENCHANCER (ERŐSÍTŐ) és silencer (csendesítő, gátló) elemek lehetnek, a szövet és fejlődési állapot-specifikus génexpresszió kulcselemei, hatásukat távolságtól és orientációtól függetlenül képesek kifejteni.

A szövetspecifictás két úton jöhet létre, vagy egy olyan aktivátor kötődik az cisz elemhez (enchancer), ami csak néhány sejttípusban van jelen, vagy, alternatív módon, egy szövetspecifikus elem egy olyan cisz elemet, mely megakadályozza a transzkripciós faktor kötődését.
2. fejezet - Genomikai vizsgálatok

1. Genomikai vizsgálómódszerek

1.1. Általános bemutatás

Az informatikának a molekuláris biológiába történő integrálódása, a bioinformatika létrejötte lehetővé tette, hogy a hagyományos genetikai vizsgáló módszerek mellett olyan technikák jöjjenek létre, melyek eredményeként a genetikai kutatások, továbbá a genetikai vizsgáló módszerek forradalmi átalakuláson mehettek keresztül. Az élő szervezeteket felépítő különböző molekuláris rendszerek működésének megismerése, az megismerést lehetővé tevő kísérletes biológiai vizsgálatok legfontosabb mozgatójává vált a genomika oldaláról történő megközelítés. Az összes génre kiterjedő génszintű megközelítések (szerkezeti) kiszélesedtek a génexpressziós változások és/vagy fehérjeszintű (funkcionális) eltérések analízisével. Létrejött a genomikai megközelítés, mely szinte a biológia minden területén a gének szerkezeti megismerése mellett jelentősen hozzájárult azok funkciójának megismeréséhez.  A genomika területén megszületett eredmények forradalmasították a biomedicinát, nemcsak az alapkutatás, de diagnosztika és terápia területén forradalmi értékű eredmények születtek.

 A biomedicina igen jelentős gyakorlati eredménye az ember genetikai állományának, a DNS bázissorendjének meghatározása, a genom kódoló szekvenciáinak megismerése, új betegség specifikus gének megismerése. Az új módszertani fejlesztések, melyek közül kiemelkedő jelentőségűek a polimeráz láncreakció (PCR), rekombináns DNS technológiák, szekvenálás, in situ hibridizációs technikák és különböző nukleinsav mikrocsip alapú módszerek kidolgozása és alkalmazása, lehetővé tették, hogy ma már nemcsak egyedi gének eltéréseit tudjuk tanulmányozni, hanem a genom egészében létrejött változások sorozatát is képesek vagyunk vizsgálni.

A biomedicinában a genomikai vizsgáló módszerek közül azoknak az eljárásoknak van kiemelkedő jelentősége, melyek szignifikánsan hozzájárulnak a betegségek iránti fogékonyság korai felismeréséhez, a betegségek progressziójában szerepet játszó genom eltérések kimutatásához, a betegségekre jellemző molekuláris eltérések diagnoszkiai értékű detektálásához és akár ezen eltérések alapján a terápia kiválasztásához, hatékonyságának monitorozásához. Ezek közé a módszertani megközelítések közé tartoznak.

- a genom eltéréseit kutató azon módszerek, melyek alkalmazásával új, betegség specifikus génpolimorfizmusok/génvariánsok (kromoszóma kópiaszám variciók) ismerhetők meg. Forradalmi lépésként említjük meg az in situ hibiridizációs módszereket (interfázisos citogenetika, array/mikrocsip alapú módszerek) PCR alapú technikák,

- gének funkcionális vizsgálatai, melyekkel különböző környezeti karcinogének okozta expozíciók mértékét jellemző funkcionális eltérések ismerhetők fel, olyan molekuláris útvonalak azonosíthatók, melyekben résztvevő funkcionális szereppel bíró molekulák terápiás célpontként a betegség hatékonyabb gyógyítását eredményezhetik.

A hagyományosan már évtizedek óta alkalmazott módszerek alkalmazásának kiterjesztéséhez, más módszerekbe történő integrálásához és új módszertani megközelítések létrejöttéhez jelentősen hozzájárultak azok az igények, melyek a genomprogramok eredményes megvalósításához szükségesek voltak. A genom vizsgálatok eredményeit a genom adatbázisok foglalják össze, melyek rendezett adatbázisok a gének tulajdonságait nemcsak szerkezeti, de összehasonlítható funkcionális szempontból csoportosítottan foglalja össze, melyek mindenki számára ingyen hozzáférhetők, és meghatározott feltételek mellett bővíthetők, aktualizálhatók.

1.2. Sanger-féle DNS szekvenálás

A nukleinsavak bázissorrendjének meghatározásához történt hozzájárulásukért két tudós, Walter Gilbert és Frederick Sanger 1980-ban kémiai Nobel-díjat kapott. Gilbert kémiai eljáráson alapuló módszere kevésbé terjedt el ugyanakkor a Sanger-féle szekvenálás széleskörű alkalmazást nyert.

A Sanger szekvenálás alapját a minden osztódó sejtben végbemenő DNS replikáció folyamata képezi. A módszer a templátfüggő DNS polimeráz enzimek azon tulajdonságát használja ki, hogy ha a szekvenálandó DNS szálhoz (templát DNS) nagy specifitással egy ismert szekvenciájú, rövid DNS szakasz (primer) kapcsolódik, majd a reakcióelegyben jelenlévő DNS polimeráz enzimek a dNTP-k felhasználásával felépítik a templát DNS szekvenciájával komplementer DNS szálat.

2.1. ábra - Sanger-féle DNS szekvenálás

A szekvenálási rekció pontosan szabályozott körülmények között zajlik.

Lépései

1. a templát DNS denaturálása (a kettősszálú DNS szálak elválnak egymástól),

2. a mintához DNS-polimerázt, primert, valamint a DNS négy dezoxi-nukleotid-trifoszfát-alkotórészét (dGTP, dTTP, dATP, dCTP: dNTP) adják,

3. ezt a primer/templát keverékének négy reakcióelegyre történő szétosztása követi,

4. az egyes részmintákhoz valamelyik nukleotid módosított formáját, a didezoxi-nukleotid-trifoszfátot (ddGTP, ddTTP, ddATP, ddCTP: ddNTP) keverik,

A módosított nukleotidok (ddNTP) abban különböznek a DNS-t felépítő nukleotidoktól, hogy nem tartalmaznak hidroxil-csoportot a dezoxiribóz 3-as szénatomján. A módosított nukleotidok közül az egyik izotóppal jelölik.

5. a szekvenálás következő lépésében a DNS polimeráz enzim jelzetlen és jelzett nukleotidokat épít be a szintetizálódó DNS szálba.

Amikor azonban egy izotóppal jelzett nukleotid (pl. [32P]ddGTP) kapcsolódik a lánchoz, a DNS szál további szintézise leáll a reakció elegyekben, mert hiányzik a DNS lánc kiegészítéséhez szükséges szabad 3'-OH végződés. A ddNTP-k mennyiségét úgy választják meg, hogy beépülésük véletlenszerű legyen és gyakoriságuk ritkán következzen be, ugyanakkor az egyfajta ddNTP-t tartalmazó reakcióelegy különböző hosszúságban, az adott dNTP minden előfordulásánál tartalmazzon a szintézist leállító jelzett ddNTP-t. A szintézissel előállított DNS fragmenteket hosszúságuk alapján denaturáló poliakrilamid gél-elektroforézisssel választják szét. A nukleotidok beépülési sorrendjét autoradiográfiával detektálják. A szintetizálódott DNS szekvenciájának leolvasása, figyelembe véve a nukleotidok felvitelének sorrendjét, az 5’ --- 3’ irányban alulról felfelé haladva történik.

A Sanger által kifejlesztett szekvenálást, mint jól bevált és viszonylag olcsó módszert hosszú éveken keresztül alkalmazták világszerte. Hátránya, hogy rendkívül munkaigényes volt, csak 400-500 bázispárnyi szekvencia egyidejű leolvasását tette lehetővé egy reakció során. A reakció detektálásához használt röntgenfilmek előhívása és a szekvencia leolvasása is hosszú ideig tartott. Ezért egyre nagyobb lett az igény a gyorsabb, hatékonyabb, radioaktív izotópokat nélkülöző automatizált módszer kifejlesztése iránt.

1.3. Automatizált DNS szekvenálás

A DNS szekvenálás automatizálásában úttörő szerepet vállalt egy kaliforniai munkacsoport (California Institute of Technology), melynek vezetője Lee Hood volt. Alap ötlet az izotóppal jelzett módosított nukleotidokat négy különböző fluoreszcens festékkel jelölték. A szekvenáláshoz így elegendő volt egyetlen reakció elegy, így a Sanger-féle szekvenálás gyorsasága már négyszeresére emelkedett. Ilyen körülmények között a fluoreszcensen jelzett ddNTP-k a szintézis leállítása mellett detektálási feladatokat is elláttak.

A szekvenálás fluoreszcensen jelzett nukleotidokkal gélben vándorló, különböző fluorofórokkal jelzett DNS fragmenteket, folyamatosan gerjesztő lézerfényforrással világítják meg. A négyféle fluoreszcens festék a rá jellemző színt bocsátja ki. Az emittált fényintenzitásokat fénydetektorokkal rögzítik, így minden DNS fragmentről pontosan megállapítható, hogy melyik fluoreszcensen jelzett ddNTP-vel végződik. A számítógéppel rögzített adatok alapján a DNS szekvenciáját a program leolvassa. Az automata DNS szekvenátorokban a DNS fragmentek molekulatömeg szerinti elválasztása poliakrilamid gélen végezték, egy DNS szekvencia leolvasásához elegendő egy gélzsebbe felvinni a szekvencia leolvasásához a mintát. A fluoreszcensen jelzett ddNTP-kről összegyűjtött adatok feldolgozása, a szekvencia betűsorrendjének lefordítása számítógépes programok segítségével történik. Az automatizálás nélkül még a legegyszerűbb genom szekvenálása is hosszú ideig tartott volna. Ennek fő oka, hogy nagy pontossággal csak rövid DNS szakaszok szekvenálhatók a módszerrel (~ 800-1000 bp), ez a méret nagyon távol esik akár egyetlen kromoszóma méretétől is, melyek hossza 50-250 millió bázis között változik. További nehézséget jelentett, hogy a szekvenálást csak az indító szekvencia (primer szekvencia) ismeretében tudták elkezdeni, ami gyakran nem állt rendelkezésre.

Ennek a problémának a kiküszöbölésére a DNS-t általában kisebb, jól kezelhető fragmentekre darabolták, majd ezt követően cirkuláris plazmidokba (hordozó bacteriális cirkuláris DNS) vagy vektorokba klónozták. A vektorok szekvenciájának ismeretében a klónozást követően bármilyen szekvenciájú DNS szakasz szekvenciáját meg lehetett határozni.

A DNS szekvenálás hatékonyságát a polimeráz láncreakció bevonásával (PCR) tovább emelték. Ennek a technikai újításnak különböző formáit fejlesztették ki. A viszonylag lassú gélről történő szekvencia leolvasást felváltották a kapilláris gélelektoforézis módszerével.

A kapilláris gélelektroforézis előnye a hagyományos eljárásokhoz képest, hogy lehetőséget nyújt a gél mátrixok összetételének széles tartományban történő változtatására, nagyszámú minta gyors és pontos analízisére, ami elengedhetetlenül szükséges volt ahhoz, hogy a Humán Genom Projekt belátható időn belül befejeződjön.

Hasznos link:

http://www.genome.gov/19519278

1.4. Genom adatbázisok, gének azonosítása

A humán genom projekt óriási adathalmazából egyértelművé vált, hogy a gének száma a korábban becsült 100 000-hez képest alacsonyabb. Jelenlegi becslések alapján mindössze 20 000 - 25 000, ez a szám sem végleges még tovább csökkenhet a jövőben. A funkcionális szereppel bíró, fehérjét kódoló gének azonosítása nem könnyű feladat a humán genomban, még a teljes DNS szekvencia ismeretében sem. A genomnak ugyanis kevesebb, mint 2%-a kódol valamilyen fehérjét, a maradék 98% szabályozó régiókat, géneket elválasztó szakaszokat, ill. a genom több mint felét kitevő ismétlődő szekvenciákat tartalmaz, melyek funkciója még ma nem tisztázott.

Az első kromoszóma (22-es kromoszóma) teljes szekvenciáját 1999-ben közölték, mely 33,4 millió bázispárból épül fel, ez a genom 1,1 százalékát jelenti. Nagyon izgalmas kérdés volt a kromoszómán található gének számának megállapítása. Amennyiben a kezdetben feltételezett 100 000 génszám igaz lenne és a gének egyenletes eloszlását feltételezik a 22-es kromoszómán legalább 1100 génnek kellett volna lenni. Ugyanakkor kiderült, hogy a gének száma ennél lényegesen alacsonyabbnak, mindössze 545-nek adódott. Hasonlóan kisebb a génsűrűség a vártnál a 22-es kromoszómával összemérhető 21-es kromoszómán, meylen mindössze 236 gént azonosítottak. Az az igen nagyszámú variáció, ami az emberi populáció tagjait jellemzi, meglepően kevés gén ellenőrzése alatt áll. Ennek elsődleges oka a gének közti kölcsönhatás, továbbá gén és környezet közötti kölcsönhatásokra vezethető vissza.

A gének azonosításának több módja ismert. Az egyik megközelítés a más fajokban is előforduló, konzervált szekvenciájú gének szekvencia-homológiájának keresésén alapul. A módszer hátránya, hogy fontos humán specifikus gének azonosítatlanul maradhatnak. Egy másik lehetőség a cDNS könyvtárakban történő génkeresés. Ezekhez az adatbázisokhoz a szekvencia adatokat úgy nyerték, hogy a sejtekből vagy szövetekből izolált RNS-t cDNS-re átírták, majd klónozást követően a DNS egy kis, kb. 500 bázispár hosszúságú szakaszát megszekvenálták, ezek a génkifeződési-markerek „expressed sequence tag” (EST) alkalmasak a cDNS azonosítására, de nem feltétlenül tartalmazzák a cDNS-t leíró lokusz genom pozícióját vagy a gén által kódolt fehérje funkcióját. A cDNS könyvtárak segítséget nyújtanak az exon szakaszok pozíciójának meghatározásában, az átírt genom szakaszok (transzkriptumok) szisztematikus megismerésében, potenciálisan új fehérje molekulák kódoló régióinak azonosításában, és mint szekvencia-címkék hozzájárulnak ismeretlen gének felfedezéséhez is. Az EST-k száma idővel olyan méreteket öltött, hogy önálló adatbázisokat kellett létrehozni a kezelésükre és a keresés megkönnyítésére. Ezek általában a nagy adatbázis gyűjtemények részét képezik, mint pl. a GenBank: National Center for Biotechnology USA (NCBI), European Molecular Biology Laboratory (EMBL) által gondozott adatbázisok valamint a Japánban a DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Az adatbankok között rendkívül szoros a kapcsolat. Az összegyűjtött szekvenciákat és a hozzájuk tartozó információkat 24 óránként egyeztetik és kicserélik egymás között, így az adatbázis felhasználók ugyanazt az eredményt kapják függetlenül, hogy a három közül melyik adatbázist használták.

2. A polimeráz láncreakció

2.1. A polimeráz láncreakcióról általában

A DNS szekvenáláshoz felhasznált DNS fragmentek amplifikálása (megsokszorozása) sokáig csak élő sejtekben un. vektorok segítségével (baktériumokban, élesztőben) volt lehetséges. 1985-ben Kary Mullis zseniális ötletére támaszkodva új eljárást, a polimeráz láncreakciót (PCR) dolgozott ki, melyért 1993-ban kémiai Nobel díjat kapott. A PCR új lehetőségeket teremtett a molekuláris diagnosztikában, forradalmasította a géntechnológiát, alkalmazásával bármilyen ismert szekvenciájú DNS-szakasz nagy mennyiségben előállítható (amplifikálható). A PCR technikával akár egyetlen példányban jelenlévő DNS darab is felsokszorozható, míg a korábbi módszerekhez (klónozás) már a kiindulásnál is nagyobb mennyiségű tisztított DNS-re volt szükség. Ennek azonban az a feltétele, hogy ismert legyen a DNS-szakasz szekvenciája legalább a szekvenálandó DNS fragment elején és végén, ezért alkalmazását csak a DNS szekvenálás és az oligonukleotid szintézis módszereinek megismerése, fejlődése tette lehetővé . A néhány nukleotidból álló DNS szakasz szekvenciájának ismeretében tudták elkészíteni a PCR reakcióhoz szükséges indítószekvenciát (primer). A primer 20-25 bázispár hosszúságú, egyszálú DNS oligonukleotid darab, ami komplementer az amplifikálandó DNS-szakasz egyik (5’), illetve másik láncának 3’-végével. A PCR reakció során legelterjedtebben alkalmazott DNS polimeráz enzim a Taq polimeráz, melyet a Yellowstone Park igen magas hőmérsékletű hőforrásaiban élő baktériumból (Thermus aquaticus) izolálták. Aktivitását megőrzi olyan hőmérsékleten is ahol a DNS-t denaturálni kell.

2.2. Polimeráz láncreakció lépései

A következő ábra foglalja össze sematikusan a Polimeráz láncreakció lépéseit.

2.2. ábra - A PCR lépései

1. a DNS templát DNS magas hőmérsékletre történő hevítése (a folyamat neve denaturáció: 94-96 oC), a DNS két szála különválik.

2. a hőmérséklet csökkentését (45-60 oC) követően a primerek a komplementer indító-szekvenciához hibridizálnak (a folyamat neve: annealing, primer kapcsolódási lépés)

3. ebben a lépésben a DNS polimeráz enzim játsza a fő szerepet, az enzim a primerektől elindulva megkezdi a templát szálnak megfelelő DNS szintézisét és létrehozza a következő ciklusban templátnak számító DNS szálakat.

4. a reakció végére az első ciklus során a kiindulási DNS-szakasz mennyisége megkétszereződik.

5. a folyamat az első lépéshez hasonlóan újra indul, azaz a reakció elegy ismételt magas hőmérsékletre történő emelésével (94-96 Co) a reakció (azaz a DNS szál felépítése) megismétlődik, és a folyamat végére a DNS mennyisége imételten a kétszeresére nő.

Kiegészítő ismeretek Polimeráz láncreakció változatai, alkalmazási területei

2.3. PCR termék detektálása gélelelektroforézissel

A gélelektroforézis során ismert méretű DNS-t használnak molekulasúly markernek, így a termék kvalitatív és kvantitatív analízise valósítható meg.

2.3. ábra - PCR termékek gélelektorforetikus megjelenítése

2.4. A PCR alkalmazásai

A PCR legnagyobb előnye óriási sokszorozó képességében rejlik. Alkalmazásával olyan vizsgálatok is megvalósíthatók, melyekhez nagyon kis mennyiségű DNS áll rendelkezésre, legyen az diagnosztikai teszt, bűnügyek során személyek azonosítása vagy kutatási feladat megvalósítása.

A PCR módszer ma már teljesen automatizált és számtalan formája létezik. Egy speciális kivitelezését jelenti a vizsgálandó szövetminta, illetve sejtpreparátum in situ vizsgálata (in situ PCR), amikor a vizsgálati mintát (szöveti metszet vagy sejtpreparátum) egy tárgylemezre helyezik. Ebben az esetben a PCR reakció a tárgylemezen valósul meg. Így nemcsak a vizsgált nukleinsav mennyiségét, hanem annak sejtszintű lokalizációját is meg lehet határozni.

A diagnosztikai alkalmazások közül kiemelkednek a fertőző ágensek (vírusok és baktériumok http://www.virologyj.com/content/pdf/1743-422X-4-65.pdf), betegség specifikus eltérések (mutációk, kromoszómaszakaszok közötti transzlokációk, deléciók, génamplifikációk) kimutatására kifejlesztett módszerek. De a módszert széles körben alkalmazzák az evolúció-, a fejlődés- és molekuláris biológiában, populációgenetikában, örökletes betegségekkel összefüggő genetikai eltérések kimutatásában, igazságügyi orvostani vizsgálatokban, rokoni kapcsolatok megállapításában, gyógyszer-kutatásban, kémiai hatóanyagok által előidézett génexpressziós változások nyomon követésében. A módszer széleskörű alkalmazást nyert a fertőző betegségeket okozó ágensek (vírusok és baktériumok) kimutatásában. A mikroorganizmusok jelenléte közvetlenül a fertőzést követően kimutathjatók, így napokkal esetleg hónapokkal a tünetek megjelenése előtt a pontos diagnózis alapján a fertőzöttek kezelése elkezdhető.

Molekuláris és PCR alapú vizsgálatok az ivóvíz minősítésére.

2.5. Génexpresszió változások kimutatása PCR-al

A PCR a DNS kiválasztott szakaszainak megsorozása mellett alkalmas a gének által átírt mRNS vizsgálatára, a génexpressziós változások detektálására is. A génexpressziós változások kimutatása reverz-transzkriptáz PCR (RT-PCR) technikával lehetséges. Elmélete azonos a DNS alapú PCR-al, azzal a különbséggel, hogy a PCR-t megelőzi egy reverz transzkripció, melynek során az egyszálú mRNS-t kettősszálú cDNS-é írják át. Erre azért van szükség, mert az RNS molekula kevésbé stabil, mint a DNS, a környezetben nagy mennyiségben jelenlévő RN-áz enzimek hatására gyorsan lebomlik. A RT-PCR egyik fő hibaforrása, hogy a PCR végtermékek mennyiségét hagyományosan a 30-40-ik ciklus után mérik, azaz akkor, amikor a reakció már a telítési fázisba került, azaz a reakció kimerült, így az elegyben lévő nukelinsav mennyiségére nem lehet már pontosan következtetni. A génexpresszió mértékének kimutatására ma már úgynevezett kvantitatív PCR (Q-PCR), vagy valós idejű PCR (real time PCR: RT-PCR) módszert alkalmaznak. A valós idejű kvantitatív PCR eljárás során a PCR-ciklusokkal egyidőben történik a keletkezett PCR termékek mennyiségének detektálása. A detektálás a fluoreszcencia energiatranszfer elvén alapul. A reakció elegyhez a normál primereken kívül két rövid próbát is alkalmaznak, melyek a primerek által kijelölt DNS szakasz megfelelő helyére specifikusak. Ezek hossza 20-30 bázis, melyeket úgy terveznek meg, hogy bekötődésük után köztük 1-4 bázis „szünet” legyen. Az egyik próba 3' végéhez zölden fluoreszkáló festéket kötnek, a másik próba 5' végét pirosan fluoreszkáló festékkel módosítják. Ha a keresett szekvencia jelen van, a két fluoreszcensen jelzett próba bekötődik a templát DNS komplementer szakaszához. Az 1-4 bázis közelségbe kerülő fluoreszcens molekulák között energia transzfer jön létre, ennek eredmény az lesz, hogy a zölden fluoreszkáló festék által emittált fény gerjeszti a másik festéket, ami piros fluoreszcenciát fog kibocsátani, ez utóbbit detektálja PCR készülék. A mérés ciklusonként történik, a keletkező fluoreszcens jel nagysága az aktuális specifikus targetek számától függ. A módszer alkalmas un. olvadáspont analízissel pontmutációk kimutatására, amennyiben a próbát a mutáció helyére tervezik.

A kvantitatív valós idejű (real-time) PCR (qRT-PCCR) módszerek kidolgozásával lehetőség nyílt arra, hogy egy adott molekuláris eltérést ne csak minőségileg, hanem mennyiségileg is meg lehessen határozni mind a DNS (kópiaszám) mind az RNS (génexpresszió) szintjén.

3. Nukleinsav alapú mikrochipek, mikro-array módszerek

3.1. A módszerekről általában

Az 1990-es évek közepéig a gének funkciójának és eltéréseinek tanulmányozása egyedi gének vizsgálatán alapult, mely igen munkaigényes, kis hatékonysággal jellemzhető megközelítés volt. Fontos, nyugodtan mondhatjuk mérföldkőnek tekinthető változás akkor következett be, amikor bevezették a DNSchip (mikrochip, génchip, génlapka) technológiát. A módszerrel lehetővé vált számos, akár több ezer vagy tízezer génfunkciójának szisztematikus analízise, méretük ugyanakkor igen kicsi, valamennyi emberi gén reprezentása elfér egy négyzetcentiméren.

A mikroarray alapú vizsgálatok felhasználási területe igen széles, alkalmazhatók:

- génkifejeződés mértékének meghatározására (mRNS expresszió),

- a génfunkciók szisztematikus analízisére,

- a DNS-ben található kis, akár egyetlen nukleotidot érintő mutációk kimutatására (egyedi nukelotid polimorfizmusok; single nucleotid polymorphism: SNP),

- nagyobb szekvenciákat magába foglaló kópiaszám variációk (copy number variation: CNV) kimutatására

- a normál genomtól eltérő változások (deléciók, amplifikációk, kromoszómák számbeli eltéréseinek, DNS hipermetiláció) felismerésére.



Yüklə 0,5 Mb.

Dostları ilə paylaş:
1   2   3   4   5   6   7




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə