Reja: Molekulyar markerlar va ularning amaliyotlarda qo‘llanishi

---

6-MAVZU: MOLEKULYAR MARKERLAR 
Reja: 
1. Molekulyar markerlar va ularning amaliyotlarda qo‘llanishi 
2. Restriksion fragmentlarning uzunligi polimorfizmi (RFLP) markerlari 
3. Oddiy takrorlanuvchi ketma-ketliklar (SSR) DNK markerlari sifatida 
4. DNKning tasodifiy amlifikasiyasi polimorfizmi (RAPD) 
5. Amplifikasiyalangan fragmentlar uzunligi plimorfizmi (AFLP) 
6. DNK restriksiya fragmentlari polimorfizmi (CAPS va dCAPS) 
Molekulyar markerlar?
• Molekulyar markerlar – irsiyatning standart qonunlari asosida bir avloddan 
keyingi avlodga ko‘chib o‘tadigan, genomning spesifik regionlarini belgilovchi 
aniq DNK ketma- ketliklari demakdir
• Ularning mavjudligi zamonaviy DNK texnologiyalari asosida aniqlanadi 
va bu biron bir belgi bilan assosiasiyalangan (bog‘langan) genlar mavjudligidan 
dalolat beradi.
Molekulyar markerlar va ularning amaliyotlarda qo‘llanishi. Molekulyar 
markerlarning rivojlanishi uchun samaradorlik, natijalarning takrorlanishi va sarf 
harajatlarning qisqarishi asosiy stimul bo‘ldi. Barcha molekulyar markerlar, ishlab 
chiqarish va aniqlash usuliga qarab uchta asosiy guruxga bo‘linadi: 1) past 
ko‘rsatkichli (RFLP kabi duragaylashga asoslangan) markerlar; 2) o‘rtacha 
samaradorlikka ega markerlar, tasodifiy amplifikasiyalangan DNK polimorfizmi 
(RAPD), amplifikasiyalangan fragment uzunligi polimorfizmi (AFLP) va 
mikrosatellit (SSR) markerlarni o‘z ichiga olgan; 3) yuqori samarali (DNK 
sekvenirlanishiga asoslangan yagona nukleotid polimorfizmi (SNP)) markerlari. 
Sohada molekulyar markerlardan RFLP (ingl. Restriction Fragment Length 
Polymorphism – restriksiyalangan fragment uzunligi polimorfizmi), PZR ga 
asoslangan DNK markerlari xususan, AFLP (ingl. Amplified Fragment Length 
Polymorphism – amplifikasiyalangan fragment uzunligi polimorfizmi), RAPD 
(ingl. Random amplified polymorphic DNA - tasodifiy amplifikasiyalangan DNK 
polimorfizmi), SSR (ingl. Simple Sequence Repeat – takrorlanuvchi oddiy ketma-
ketliklar), STS va EST-SSR kabi xilma-xil DNK markerlari va SNP markerlari 
keng qo‘llaniladi.
Molekulyar markerlarning rivojlanishi uchun samaradorlik, natijalarning 
takrorlanishi va sarf harajatlarning qisqarishi asosiy stimul bo‘ldi. Barcha 
molekulyar markerlar, ishlab chiqarish va aniqlash usuliga qarab uchta asosiy 
guruxga bo‘linadi:
1) past ko‘rsatkichli (RFLP kabi duragaylashga asoslangan) markerlar;

---

2) o‘rtacha samaradorlikka ega markerlar, tasodifiy amplifikasiyalangan 
DNK polimorfizmi (RAPD), amplifikasiyalangan fragment uzunligi polimorfizmi 
(AFLP) va mikrosatellit (SSR) markerlarni o‘z ichiga olgan;
3) yuqori samarali (DNK sekvenirlanishiga asoslangan yagona nukleotid 
polimorfizmi (SNP)) markerlari. RAPD, AFLP va SSR markerlari tadqiqotchilar 
tomonidan turli xil o‘simlik turlarida ishlatiladigan DNK markerlarining asosiy 
turlari hisoblanadi. RAPD markerlari bir vaqtning o‘zida genomning turli 
hududlaridagi polimorfik lokuslarni aniqlashning imkonini beradi. RAPD 
markerlarida, DNK fragmentlari tasodifiy praymerlardan (odatda 10 nj) foydalanib 
PZR reaksiyasi orqali amplifikasiyalanadi. Polimorfizm genom ketma-ketligidagi 
o‘zgarishlar tufayli yuzaga keladi. RAPD markerlar tizimi qo‘llanilishi juda oson, 
sekvens ma'lumotlari zarur emas va DNK juda kam miqdorda talab etiladi hamda 
avtomatlashishga to‘liq javob beradi. Biroq, ushbu usul past takrorlanuvchanlikka 
ega. RAPD markerlaridan g‘o‘zada ko‘plab maqsadlar uchun foydalanilgan 
xususan, xilma-xillikni baholash, genom kartalashtirish, filogenetik tadqiqotlar, 
populyasiyada genetik o‘zgaruvchanlik, DNK asosida molekulyar pasport yaratish 
hamda tur ichi va turlar aro genotiplar o‘rtasidagi qarindoshlikni aniqlash. 
G‘o‘zada RAPD dan oqqanot, shira va kanalarga chidamli navlarni farqlab olish 
uchun foydalanilgan.
G‘o‘zada erkak sterilligi geni uchun RAPD markeri (R6592) aniqlangan. 
RAPD usuli g‘o‘za genotiplari o‘rtasidagi genetik aloqalarni baholashda, g‘o‘zada 
birikish kartasini tuzish va stomatal (ustisa) o‘tkazuvchanlik QTL larini 
identifikasiya qilishda foydalanilgan. AFLP markerlari yuqori darajada 
takrorlanuvchanlik va yuqori sezuvchanligi bois kam o‘rganilgan yoki umuman 
o‘rganilmagan genomlarga ega to‘qimalarning molekulyar genetikasini 
o‘rganishda keng qo‘llaniladi.
Bu usul RFLP ning ishonchliligi va RAPD ning qulayligi bilan 
uyg‘unlashtirilgan usul hisoblanadi. Jarayon oddiy uch bosqichni o‘z ichiga oladi:
1) genom DNKni kesish va oligonuleotid adapterni ulash;
2) restriksiya fragmentlarining oldindan va selektiv amplifikasiyasi;
3) amplifikasiyalangan fragmentning gel' elektroforez tahlili.
Polimorf fragmentlar gelda namoyon bo‘lishi yoki bo‘masligining 
aniqlanishi bilan AFLP ni dominant marker tizimiga aylantiradi. Ushbu usul 
avtomatlasha oladi va bir vaqtning o‘zida har bir tajriba bo‘yicha ko‘plab genetik 
lokuslarni tahlil qilish imkonini beradi. AFLP har bir praymer uchun RFLP, SSR 
yoki RAPD markerlariga qaraganda ko‘proq polimorf lokuslarni hosil qiladi. 
AFLP genetik xilma-xillikni tadqiq etish, molekulyar pasportlash tadqiqotlari 
hamda agronomik muhim, chigit va tola sifat belgilarini markerlashda samarali 
vositadir. AFLP genom bo‘ylab tasodifiy va juda ko‘p tarqalganligi tufayli genlarni 

---

kartalashtirish tadqiqotlarida katta ahamiyatga ega bo‘lgan uslub hisoblanadi. 
AFLP va RAPD markerlaridan foydalanib, g‘o‘zaning birikkanlik kartasi 
yaratilgan. AFLP markerlari shuningdek, g‘o‘zaning genetik xilma-xilligini 
o‘rganish va g‘o‘za genetik kartasini boyitish uchun ishlatilgan. AFLP 
markerlaridan tashqari g‘o‘za genomini tadqiq etishda SSR markerlaridan ham 
keng foydalanilmoqda.
XXI asrga kelib SSR markerlari “Eng ommabop markerlar” ga aylandi. SSR 
markerlari o‘ta takrorlanuvchan, yuqori darajada polimorf, RAPD va AFLP dan 
farqli ravishda avtomatlashadi hamda aksariyat hollarda anonim markerlar 
hisoblanmaydi. Bugungi kunda SSR markerlari molekulyar genetika va 
seleksiyaning barcha sohalariga kirib keldi. Biroq, oxirgi paytlarda SNP 
markerlarining sohaga kirib kelishi bilan, SSR markerlarining hukmronligi nihoyat 
buzildi. Genomning har ikkala kodlaydigan va kodlamaydigan xududlarida juda 
ko‘p tarqalgan nukleotidlarning ikki, uch, to‘rt yoki beshta tasodifiy takrorlari 
mavjud.
Mikrosatellit markerlar genomning qisqa takrorlanuvchi DNK ketma-ketligi 
asosida yaratilgan. Ushbu markerlarning lokuslari turlar bo‘yicha yuqori darajada, 
taxminan 50% o‘tkazilishi mumkin. Qisqa takrorlanuvchan DNK ketma-ketliklari 
ko‘p alleli, ko- dominant PZRga asoslangan molekulyar markerlar uchun asos 
yaratadi va boshqa DNK markerlariga taqqoslaganda yuqori polimorf hisoblanadi. 
SSR markerlari o‘zlarining yuqori polimorfizmi tufayli molekulyar pasportlash, 
genetik xilma-xillikning tahlili, molekulyar kartalashtirish va markerlarga 
asoslangan seleksiyada juda muhim markerlar tizimi hisoblanadi. G‘o‘za 
tadqiqotchilari takrorlanuvchi oddiy ketma-ketliklar (SSR)dan polimorfik va 
xilma-xillik tahlillari, genetik kartalashtirish va assosiativ kartalashtirish 
tadqiqotlarida foydalanishdi.
Bundan tashqari, SSR markerlaridan foydalanib g‘o‘zada qimmatli xo‘jalik 
belgilariga genetik bog‘langan DNK markerlarini identifikasiya qilishda olimlar 
tomonidan ko‘plab tadqiqotlar olib borilgan. Jumladan, Chengqi Li boshchiligidagi 
bir gurux xitoy olimlari AQShlik hamkasblari bilan hamkorlikda g‘o‘zada 
hosilning erta pishishiga javobgar bo‘lgan 54 ta QTL aniqlashdi hamda MAS 
dasturida foydalanish uchun taqdim etishdi. Yana bir gurux xitoy olimlari Hantao 
Wang va boshqalar tomonidan g‘o‘zaning SSD usulida yaratilgan 178 ta 
rekombinant inbred liniyalari (RIL) yaratilab, ularda 644 polimorf lokuslardan 
foydalanib genetik karta tuzildi. RILlar 8 ta turli muhitlarda fenotiplanib, 134 ta 
QTL identifikasiya qilishdi. Tadqiqot natijasida shulardan 64 tasi tola sifatiga va 
qolgan 70 tasi hosildorlikka aloqador QTL lar ekanligi aniqlandi. 
Yagona nukleotid polimorfizmi (SNP) markerlarining tadqiqotlarda 
fodalanilishi SSR markerlarining hukmronligiga yakun yasadi. Dastlab, inson 

---

genomini tadqiq qilish jarayonida ishlab chiqilgan SNP markerlar tizimi o‘zining 
universalligini namoyon etdi va bir turdagi individlar orasida genetik 
o‘zgarishlarning eng keng tarqalgan shakli ekanligini isbotladi. Biallel' tabiatga ega 
SNP markerlarining polimorfizm xususiyati SSR markerlarinikiga nisbatan 
pastroqdir. Shunday bo‘lsada, SNP hududlari genomda ko‘p uchrashi va keng 
tarqalganligi bois ushbu marker tizimining samaradorligi yuqori bo‘lib, asosiy 
qulaylik tomoni yuqori darajada avtomatlashtirilganligidadir. Shu sababli ham 
hozirgi kunda SNP markerlari, o‘simliklar molekulyar genetikasi va seleksiyasida 
keng qo‘llanilmoqda. SNP markerlarining asosiy afzalliklari ularning 
moslashuvchanligi, tezligi va iqtisodiy samaradorligi bilan birga ma'lumotlarni 
boshqarishning qulayligi bilan bog‘liq.
Individual genomdagi yagona nukleotid farqlari (A, T, G va S) yagona 
nukleotid 
polimorfizmi 
yoki 
SNPlar 
deb 
yuritiladi. 
Bu, 
genomning 
kodlamaydigan, kodlaydigan va genlar aro hududlarida bo‘lishi mumkin, shu 
sababli nukleotidlar ketma-ketligidagi o‘zgarishlarga qarab genlarni aniqlashga 
imkon beradi. SNP markerlari birikkanlikni kartalashtirish, kartaga asoslangan 
klonlash va markerlarga asoslangan seleksiya uchun o‘zlarining yuqori darajadagi 
polimorfizmi tufayli juda muhim vositaga aylandi. SNP larning ko-dominant 
tabiati ushbu markerlarni allellarning gomozigota va geterozigota xolatini farqlash 
imkoniyatini yuzaga chiqardi.
G‘o‘zada, Gossypium genomining nukleotid ketma-ketliklaridagi SNP 
larning xilma-xilligini kuzatish, tavsiflash va kartalashtirish bo‘yicha ko‘plab 
tadqiqotlar o‘tkazilgan. Halqaro hamkorlikda Illumina Infinium genotiplash tahlili 
platformasi asosida 70 ming SNP chip ishlab chiqildi. Bu kabi yuqori samarali 
platformalar seleksionerlar, genetiklar va boshqa tadqiqotchilar uchun g‘o‘za 
genomni sekvenirlash tahlillarida, genetik va seleksion dasturlarda qimmatli manba 
bo‘ladi. Barcha turdagi DNK markerlarini ishlab chiqish odatda ikki bosqichdan, 
ya'ni markerlarni aniqlash hamda ularning ishonchliligini tekshirishdan iborat.
Agar DNK markerlari biron-bir belgiga birikkanligi tasdiqlansa, ular 
qimmatli markerlar hisoblanadi. Bunday markerlar molekulyar genetika va 
o‘simliklar seleksiyasining turli yo‘nalishlarida xususan, miqdoriy belgilar 
gen/lokuslarini (QTL) kartalashtirish, noteng birikkanlik (ingl. Linkage 
Dissiquilibrium - LD) asosidagi assosiativ kartalashtirish (AK), gen/QTL larni 
klonlash, germoplazma xususiyatlarini baholash, genetik diagnostika, belgilarni 
markerlarga asoslangan seleksiya (MAS) usuli orqali introgressiya qilishda 
foydalanilishi mumkin. Tadqiqotchilar yuqorida ta'kidlab o‘tilgan markerlardan 
foydalanishlari uchun, ularning rekombinasiyaga asoslangan genetik birikkanlik 
kartalarini yaratish orqali xromosomalardagi joylashish tartibi aniq bo‘lishi lozim. 

---

7- MAVZU: GENOMNING DNK DARAJASIDAGI TAHLILI 
Reja 
1. Genom DNK sini ajratish
2. Polimeraza zanjir reaksiyasi
3. Gel-elektroforez metodi
DNKni to‘qimalardan ajratish uchun hujayra organoidlari va 
membranalarining bo‘laklari sentrifugalash uslubi yordamida homogenatdan 
olinadi. DNKni to‘qimalardan ajratish jarayonida u parchalanadi. Olingan DNK 
molekulalari dastlabki molekulalarga qaraganda ancha kichik, ammo ular yuqori 
molukulyar massaga ega bo‘ladi. Bunday molekulalar tadqiqot uchun qulay emas 
va ular yana parchalanishi kerak. Parchalanish uchun bakteriyalardan ajratilgan 
restrikataza fermentlari ishlatiladi. 
Genomning DNK darajasidagi tahlili 3 bosqichga bo‘linadi: 
• 
Ob'ektni tanlash
• 
Tanlangan ob'ektga mos metodni tanlash
• 
Natijalarni 3 takroriy tajriba asosida xulosalash 
DNK tahlili qo‘llaniladigan sohalar
• 
O‘simliklar va hayvonlar sistematikasi
• 
Tibbiyotda (patogen mikroorganizmlar zararini kamaytirish)
• 
Tibbiy diagnostika (tashxis qo‘yish)
• 
Sud ekspertizada
• 
Kriminalistikada
• 
Idenfikasiyalanish (shaxsni aniqlash)
• 
Arxeologiya, paleontologiya va etnogenetika 
DNK ajratib olishning bir necha usullari mavjud:
• 
Fenol-xloroformli usul
• 
STAB usuli
• 
Silikagelli usul
• 
GuSCN + SiO2 li metod yordamida DNK ni ajratib olish. 
STAV usuli. Bu usulni qo‘llab o‘simlik to‘qimasidan genom DNKsi ajratish 
anchagina samarali va sifatlidir. Bu usulda barcha o‘simlik turlaridan DNK ajratish 
mumkin bo‘lib, ishlatilayotgan reagentlar inson salomatligi uchun xavfsiz va 
boshqa usullarga qaraganda arzon hisoblanadi va bir nechta bosqichda amalga 
oshiriladi:
DNK ajratish uchun to‘qima tanlash. hujayralar soni kam va DNK miqdori 
ko‘p bo‘ladiganlarini, imkon darajasida DNK to‘qimadan oson ajraladigan 

---

shuningdek, hujayralari oqsillar, lipidlar yoki polisaxaridlar bilan to‘yinmagan 
bo‘lishi kerak.
To‘qimalarni hujayra darajasigachaga parchalash. DNK to‘qimasini 
hujayralar darajasigacha parchalash uchun uni farfor idishga solinadi va ustiga -
800C li suyultirilgan azot quyilib, chinni xovoncha yordamida eziladi. 
Yirik molekulalarning ajralishi. Hujayra membranasi va uning yadrosini 
eritish uchun 650C xaroratda 45 daqiqa davomida 2xCTAV bufferida inkubasiya 
qilindi.
Oqsillardan tozalash. xloroform: izoamil spirti (24:1) aralashmasi qo‘shilib, 
Sentrafuga qilinadi. Supernatant yangi probirkaga olinadi va ustiga (suyuqlikdagi 
DNKni ivishi uchun) CTAV presipitasiya bufferidan qo‘shiladi.
DNK suspenziyasini RNK dan tozalash. RNKaza fragmenti qo‘shilgan 
yuqori tuzli buffer bilan qayta ishlanadi.
DNK molekulalarini cho‘ktirish. 96% li etil spirti qo‘shiladi. DNK 
spirti bilan ikki marotaba yuviladi. 
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PZR) Ba‘zi tadqiqotlar uchun juda ko‘p 
miqdordagi yaxshi tozalangan yuqori molekulyar og‘irlikdagi DNK juda 
muhimdir. PCR usuli DNKning in vitro kichik qismlarini tanlab sintez qilishga va 
3-4 soat ichida o‘rganilayotgan fragmentning bir necha million nusxasini olishga 
imkon beradi. DNK ob‘ektlari sifatida qon, to‘qima biopsiyasi, so‘lak, siydik, 
amniotik suyuqlik va boshqalarni ishlatish mumkin. 
Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR). Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) 
metodi molekulyar biologiyada juda muhim o‘rin tutib, ushbu usul 1983- yili 
Koliforniyadagi Setus kompaniyasining bioximigi Keri Myullis tomonidan kashf 
etilgan. Bu kashfiyoti uchun Keri Myullis 1993-yilda Nobel mukofotiga sazovor 
bo‘lgan. Bu usulning yaratilishiga DNK polimeraza fermentining yaratilishi sabab 
bo‘lgan. Ushbu ferment PZR metodi bo‘yicha boradigan analiz jarayonlarini 
katalizlaydi va nazorat qiladi. Bu fermentning muhim ahamiyati shundaki, u 
issiqlikka chidamli bo‘lib, ancha yuqori haroratda ham o‘z faolligini yo‘qotmaydi. 
Uning faolligini namoyon qiluvchi optimal temperatura 72S.
PZR analizi 3 ta bosqichda amalga oshadi:
DNk ni ajratib olish
DNK fragmentlarining amplifikasiyasi
DNK amplifikal mahsulotlarining deteksiyasi. Pzr natijasida DNK zanjiri 
fragmentining kopiyasi olinadi. Spesifik aniq organizmlar uchun shunaqa aniq bir 
uchastkalarni qidirish talab etiladi. 
PZR jarayoni quyidagi bosqichlarda amalga oshadi. 

---

PZR mexanizmi 
Pzr metodining mohiyati 
• 
Test sistemalar-DNK amplifikasiyalarini tuzishda odamdagi bakteriya 
va viruslarni, turli patogenlarni aniqlash uchun xizmat qiladi.
• 
Ko‘pgina patogen bakteriyalar uchun PZR metodi effektli hisoblanadi. 
Laboratoriyalarda bakteriyalar miqdori ko‘paytiriladi. Bunda avval DNK ning 
kerakli qismlari tanlab olinib kerakli miqdorgacha ushbu metod yordamida 
ko‘paytiriladi.
• 
DNK chipi-genetik mutasiyalar yoki siljishlarni aniqlash uchun 
maxsus chip, kasalliklarni aniqlash hamda shu kasallik belgilarini o‘zida saqlovchi 
genetik kartalashtirilgan DNK ning aynan nusxasi ko‘chirilgan maxsus 
laboratoriyalarda ishlab chiqilgan mikrochip ko‘rinishidagi qurilma.
• 
SNP lex nukleotid polimorfizmi-genotiplarni tahlil qilish uchun 
polimeraza zanjir reaksiyasi va kapillyar elektroforezdan foydalanishdir.
• 
Dnk mikrolizasi metodi-Dnk molekulalarini shisha, plastmassa yoki 
silikon platformasida tashkil etish. Ko‘p sonli DNK fragmentlari tuzilmasi maxsus 
DNK chiplardagi ma'lumotlar bilan tekshiriladi.
Ajratilgan genom DNK si va PZR tahlilini gel'-elektroforez usulida 
tekshirish. 
Dastlab namunalarning DNK konsentratsiyasi 0,9 % li agaroza gelida, aniq 
(25 ng/μl) konsentratsiyali lyambda (λ) fagining DNKsiga taqqoslanib, gel' 
elektroforez usuli yordamida aniqlanadi. So‘ngra, PZR amplifikasiya mahsulotlari 
3,5 % agaroza gelida tekshiriladi. Gellar etidium bromid yordamida bo‘yaladi va 
ultrabinafsha nuri ta'sir ettirilib, Alpha Imager gel- hujjatlashtiruvchi qurilmada 
suratga olinadi.