Spor, Kapsül ve Flagella Boyama

Spor, Kapsül ve Flagella Boyama
Özet:

Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile görülmeleri zordur. Mikroorganizmaların ve onlara ait spor, flagella, kapsül gibi morfolojik özelliklerinin mikroskopta görünür hale getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyama yapılır. Bu işlemin sonucunda mikroskop incelemesi için daha görülebilir hale gelen mikroorganizmalar daha rahat tanımlanabilir ve gruplandırılabilirler. Böylece bir gıda maddesi üzerinde üreyebilecek canlılar belirlenmiş olur.

 

Giriş:

Boya bir benzen halkasına bağlı kromofor ve okzokrom gruplarını taşıyan organik bir bileşiktir. Kromofor grup moleküle renk özelliği verir, ancak bu bileşik renkli olmasına rağmen henüz boya karakterinde değildir. Bu maddenin herhangi bir ortama tutunma özelliği yoktur. Bu özellik okzokrom grubu ile sağlanır. Okzokrom grubu moleküle elektrolitik çözünme özelliği vererek tuz meydana getirilmesini sağlar. Okzokrom grubu boyanın renk tonunu değiştirebilir. Ancak rengin ortaya çıkmasını sağlayamaz.

Bir çözücüde pozitif yüklü iyonlar veren boyalara bazik boyalar denir. Örnek olarak bazik fuksin, kristal violet, metilen mavisi ve safranin verilebilir. Çözücüde negatif yüklü iyonlar veren boyalara ise asit boyalar denir: Nigrosin, eosin, asit fuksin. Bazik ve asit boyaların uygun oranda karışımları ile nötr boyalar elde edilir: Giemsa, leishman.

Bazı kimyasal maddeler; boyanacak madde ile boyanın birleşmesini kolaylaştırır veya kuvvetlendirir. Bunlara mordant adı verilir: Tannik asit, fenol, çinko, amonyum oksalat, iyot.

Boyama yöntemleri ile mikroorganizmaların sınıflandırılması ve tanımlanması, genel olarak şeklinin gözlenmesi mümkündür. Boyama ile bir gıda ürününün ekim işleminden sonra açığa çıkan kültürlerden şüphe duyulanların hangi mikroorganizmalar olduğu belirlenir. Böylece insan sağlığı açısından güvenilir bilgiler elde edilebilir. Ayrıca boya maddeleri mikroorganizmaların boyanmasının dışında başka amaçlar için de kullanılmaktadır. Örneğin trifenil içeren bazı boyalar(malachit yeşili, kristal violet) bazı mikroorganizmalar üzerine öldürücü etkiye sahip olduklarından, mikroorganizmaların izolasyonunda besi yerine inhibitör ajan olarak ilave edilmektedir. Böylece istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önleyerek besi yerine seçici özellik kazandırır.

Boyama yöntemleri temel olarak üç grupta toplanır: Basit boyama, diferansiyel boyama ve hücrenin spor, flagella, kapsül gibi kısımlarının boyandığı özel boyama yöntemleri.

Boyama Yöntemleri:

·        Basit Boyama

·        Gram Boyama

·        Endospor Boyama

·        Flagella Boyama

·        Kapsül Boyama

·        Küf Boyama

 

Spor Boyama:

Bazı bakteriler yüksek sıcaklık, düşük su aktivitesi gibi dış ortam koşullarına dayanıklı spor oluştururlar. Bakteri hücresinin içinde oluşan bu spora endospor denir. Her bakteri kendine özgü pozisyon, biçim ve büyüklükte spor oluşturur. Sporların bakteri hücresinde bulunma

şekilleri farklılık gösterir.

Gram boyamada kullanılan boyalar spor çeperine nüfuz edemediklerinden gram boyama yöntemi ile boyanmazlar. Sporların görünmesi amacıyla en yaygın olarak kullanılan yöntem Schaffer-Fulton yöntemidir. Bu yöntem ile boyanan sporlar mikroskopta yeşil, hücreler ise pembe-kırmızı renkte görülürler.

Materyal:

·        Lam

·        Öze

·        Besiyerinde bakteri kültürü

·        Boya çözeltileri: malachit yeşili, safranin

·        %95’lik etil alkol

·        Kurutma kağıdı

·        İmmersiyon yağı

·        Mikroskop (100X obj.)

 

Metot:

Ø      Temiz bir lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır.

Ø      Öze bunzen alevinde sterilize edilir,soğuması için kısa süre beklenir.

Ø      Steril öze ile katı besiyerinden bir miktar kültür alınır.

Ø      Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır.

Ø      Öze bunzen alevinde sterilize edilip,yerine konur.

Ø      Preparatın kuruması için bir süre beklenir.

Ø      İyi bir tespit için pens yardımıyla ucundan tutulan lam bunzen aleviden 20 kere geçirilir.

Ø      Preparatın üzeri kurutma kağıdı ile kaplanır, üzerine malachit yeşili çözeltisi dökülür.

Ø      Preparat hafif alev üzerinde veya su banyosunda 5 dakika ısıtılır. Ancak preparatın kurutulmamasına dikkat edilmelidir. Gerektiğinde üzerine boya ilave edilir.

Ø      Preparat yavaş bir şekilde musluk suyu ile 10 saniye yıkanır.

Ø      Karşıt boyama için safranin ile 15 saniye boyanır.

Ø      Su ile yıkanır, kurutma kağıdı ile kurutulur.

Ø      Yağ damlatılarak 100X objektif ile incelenir.

 

 

Flagella Boyama:

Pseudomonas gibi bazı bakterilerin hareketli organeli olan flagella ince ve narin bir yapıdır. Bu boyamada amaç flagellanın boyanması olup, boyamada en çok carbolfuchsin kullanılır, ayrıca boyayı kuvvetlendirici mordant ilave edilmelidir. Boyama sonucunda flagella ve bakteriler pembe ve kırmızı renkte boyanırlar.

 

Materyal:

·        Lam

·        Öze

·        Besiyerinde taze bakteri kültürü

·        Boya: carbolfuchsin mordant

·        %95’lik etil alkol

·        Kurutma kağıdı

·        İmmersiyon yağı

·    Mikroskop (100X obj.)

 

Metot:

Ø        Katı besiyerindeki kültürün üzerine birkaç damla steril su damlatılır.

Ø      Bakteriler fazla karıştırılmadan öze yardımıyla lamın üzerine alınır.

Ø      Lam eğilerek bakteri süspansiyonunun aşağı doğru akması temin edilir ve bu şekilde kurutulur.

Ø      Üzerine mordant carbolfuchsin çözeltisi damlatılır, 10 dakika beklenir.

Ø      En uygun boyama tecrübe ile sağlanır. Preparat koyu bir zemin üzerine konur ve aglütinasyon olduğunda boyamaya son verilir.

Ø      Lam eğilerek boya su ile uzaklaştırılır ve dik durumda kurutulur(kurutma için filtre kağıdı kullanılmaz).

Ø      İmmersiyon yağı damlatılarak 100X objektifte incelenir.

 

 

 

Kapsül Boyama:

Bazı bakteriler kendisine hastalık yapma yeteneği kazandıran jelatinimsi yapıda kapsül içerirler. Kapsül suda eridiğinden ve boyanması mümkün olmadığından ortam nigrosin gibi koyu renk bir boyayla, hücre safranin ile boyanır. Kapsülün varlığı hücre etrafındaki boyanmamış bölge ile anlaşılır. Bakteri pembe, ortam gri, kapsül renksiz görünür.

 

Materyal:

·        Lam

·        Öze

·        Besiyerinde taze bakteri kültürü

·        Boya çözeltileri: nigrosin veya çini mürekkebi, safranin

·        %95’lik etil alkol

·        Kurutma kağıdı

·        İmmersiyon yağı

·        Mikroskop (100X obj.)

 

Metot:

Ø        Basit boyamada olduğu gibi preparat hazırlanır.

Ø        Hafifçe alevden geçirilir.

Ø        Nigrosin veya çini mürekkebi damlatılır.

Ø        Süspansiyon lam 45^o eğilerek lamel ile yayılır ve kuruması beklenir.

Ø        Preparat karşıt bir boya olan safranin ile kaplanır ve 30 saniye beklenir.

Ø        Boya dökülür ve filtre kağıdı arasında hafifçe fazla suyu alınır, havada kurutulur.

Ø      İmmersiyon yağı damlatılarak 100X objektifte incelenir.

 

 

Kullanılan Boya Çözeltileri:

Carbolfuchsin

Ziehl-Nielsens corbolfuchsin 10 ml

Saf su 150 ml

Malachit Yeşili

Malachit green 5 g

Saf su 100 ml

Safranin

Safranin 0.5 g

Saf su 100 ml

Nigrosin

Çini Mürekkebi

 

Sonuç:

Besiyerlerinden alınan kültürler metotlarda anlatıldığı gibi boyandı ancak spor, flagella veya kapsül mikroskop incelemesi sonunda gözlemlenemedi.

Yorum:

Deneyde uygulanan yöntemlerden sonra başarılı sonuç elde edilememesinin başlıca sebebi deney sırasında yapılan hatalardır. Bu hatalar “Hata Kaynakları” başlığı altında incelenebilir.

 

Hata Kaynakları:

·        İstenilen özellikteki mikroorganizmalarla çalışılmaması.

·        Besi yerinden kültür alımına dikkat edilmemesi.

·        Preparat alınırken kültürün lam üzerindeki su ile iyice karıştırılmaması.

·        Mikroorganizmaların lam üzerine iyice fiksasyon edilmemesi.

·        Damlatılan boyaların gereğinden fazla veya az damlatılması.

·        Bekleme sürelerinin yeterli olmaması.

·        Su ile yıkamada mikroorganizmaların kayıp olması.

·        Kurutma kağıdının fazla bastırılması.

·        Yanlış boya çözeltileri kullanılması.

 

 

Referanslar:

Ø      HEPERKAN, D.1998, Basılmamış Veri,Gıda Mikrobiyolojisi Ders Notları, İTÜ Gıda Mühendisliği Bölümü, İstanbul