Synthetic Biology Final Report

Synthetic Biology | State of the Art 
 
20 
immunosuppressors), lipids (dietary supplements, pharmaceuticals and biodiesels) and isoprenoids (perfumes, 
biodiesels, antimalarial drugs, antibiotics, rubber, dietary supplements, food ingredients and vitamins). 
3.1.4
 
Cell-free synthetic biology 
An alternative and emerging field is cell-free biology, which is defined as the “activation of complex biological 
processes  without  using  intact  living  cells”  (Harris  and  Jewett  2012).  It  features  the  ability  to  focus  on 
production of a single compound without physical barriers, facilitates substrate addition, product removal and 
rapid sampling, provides direct access to reaction conditions, and utilises the entire reactor volume. Another 
advantage is that there is no conflict between microbial growth and engineering design objectives. The most 
prominent example is cell-free protein synthesis (CFPS), which allows for the synthesis of proteins containing 
non-natural  amino  acids (NNAA,  see  also 3.2.3.). Major  application-oriented  advantages of  cell-free  systems 
are that gene expression of multiple products may be tuned to facilitate proper product interactions, reaction 
and product stability may be optimised by adjusting DNA template concentrations and controlling the redox 
potential for optimal disulphide bond formation, the possibility for recombinant expression of toxic proteins, 
and the  production of complex biocatalysts  (Smith et al. 2014). They overcome inherent limitations of living 
cells,  enable  control  of  gene  expression,  chassis  optimisation,  in  situ  monitoring,  and  automation.  Cell-free 
systems are used to develop new reaction pathways that significantly increase productivity, e.g. to microbe-
based  systems.  It  also  allows  for  the  faster  and  more  predictable  development  of  modular  gene  circuits,  as 
control  of  reaction  environment  and  components,  and  access  to  the  reaction  is  greatly  facilitated  – 
applications are the engineering of minimalistic artificial cells and cell-like microdevices. 
3.2
 
Construction of a novel cell 
Designed and synthesised DNA segments that encode novel functions need to be implemented into a suitable 
organism  by  one  of  the  many  available  genome  engineering  techniques  or  by  novel  mega-size  cloning 
strategies  (Heinemann  and  Panke  2006).  Complexity,  the  major  problem,  is  desirable  to  be  reduced.  One 
option  is  to  reduce  the  genome  of  the  host  into  which  the  new  sequence  is  implemented,  which  would 
eliminate  many  possibilities  for  interference.  Since  numerous  genes  are  involved  in  cell-cell  communication 
while  others  have  been  shown  to  be  non-essential  to  cell  function  it  was  early  suggested  that  it  would  be 
possible to reduce genome complexity to a minimal set of genes able to sustain cell life and reproduction (Sole 
et  al.  2007).  No  matter  how  small,  cell  genomes  must  contain  all  the  information  necessary  for  the  cells  to 
perform essential functions allowing them to maintain metabolic homeostasis (self-maintenance), reproduce 
(self-reproduction) and evolve (evolvability) – the three main properties of living cells. 
It is important that the synthetic device or system is either decoupled from the metabolic processes inherent 
to the viability of the cell or does not adversely affect these processes.  
“Microbial synthesis of any plant natural product can be achieved by „precursor-mediated product synthesis“, 
in which an existing host pathway is altered to incorporate a heterologous pathway, or by „de novo synthesis“, 
in  which  new-to-host  biosynthetic  routes  are  imported.  Global  approaches  have  been  applied  to  improve  for 
example the terpenoid pathway flux in microbial host” (Moses et al. 2013). 
3.2.1
 
Minimal genomes – top-down approach 
A  minimal  genome  is  the  minimum  set  of  genes  that  is  necessary  for  a  cell  to  propagate  under  specific 
environmental conditions (Heinemann and Panke 2006).  
According to theoretical considerations, growth in the  presence of a rich but synthetic and defined medium 
requires  as  few  as  206  genes,  basically  comprising  the  DNA  replication,  transcriptional  and  translational 
machinery,  rudimentary  DNA  repair  functions,  protein  processing  and  degradation,  cell  division  and 

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
21 
rudimentary  metabolic  and  energy  functions  (Heinemann  and  Panke  2006).  Relatively  large  genomes  of 
established models can, on the one hand, be substantially reduced to reach this goal or, on the other hand, 
one  can  work  on  the  already  very  small  genome  of  other  organisms  in  exchange  for  the  requirement  to 
develop  novel  molecular  biology  tools  (Heinemann  and  Panke  2006).  The  smallest  genome  sizes  have  been 
detected  in  prokaryotic  cells  living  in  symbiosis  with  other  organisms.  Notable  examples  are  the  human 
parasite  Mycoplasma  genitalium,  the  archaeal  exosymbiont  Nanoarchaeum  equitans,  the  insect 
endosymbionts  Buchnera  aphidicola  BCc,  Candidatus  Carsonella  ruddii  and  Candidatus  Sulia  muelleri.  All  of 
these  microorganisms  are  heterothroph  host-dependent  bacteria.  They  are  dependent  on  the  chemically 
complex environment  represented by their respective  host  cells. As an adaptation to the symbiotic  lifestyle, 
their  genomes  underwent  a  reductive  process  in  which  genes  that  were  unnecessary  in  the  new  protected 
environment or redundant because their functions were provided by the host tended to be lost  (Moya et al. 
2009). 
Which are the essential genes?  
The  first  step  of  making  a  minimal  cell  is  to  answer  the  question  about  how  many  genes  are  necessary  to 
support cellular life. Whether a gene is essential depends on the environmental conditions.  Esvelt and Wang 
(2013) define a set of useful traits for a biological chassis as: 
-
 
Fast growing in minimal media with glucose 
-
 
Capable of fermentation 
-
 
Amenable to genetic manipulation 
-
 
Minimally sufficient such that removal of any additional gene negatively affects the other three stated 
considerations 
One way to approach the gene composition of a minimal genome is by comparative genomics. The underlying 
hypothesis  is  that  genes  shared  between  distantly  related  species  are  likely  to  be  essential.  It  has  to  be 
mentioned  that  there  is  an  intrinsic  limitation  of  this  method:  Many  essential  cellular  functions  can  be 
performed by several alternative and unrelated proteins, and will be misled by comparative approaches. The 
comparative minimal core (common set of genes) only retrieves those genes involved in functions for which 
there is no alternative in nature. The task of determining if there is a minimal deletion core is difficult because 
of three critical issues: 
1.
 
Redundancy  might  only  be  apparent:  Inactivation  of  single  genes  does  not  detect  essential  functions 
encoded  by  redundant  genes,  and  some  individually  dispensable  genes  may  not  be  simultaneously 
dispensable, a phenomenon called synthetic lethality (Moya et al. 2009). 
2.
 
The  mechanism  of  cell  division  is  not  yet  completely  understood:  Theoretical  considerations  of  self-
reproduction  (transcription/translation  machinery,  replication  machinery  and  regulation)  apply  well  to 
automatic schemes, but it is not guaranteed that this also works in an artificial cell (Noireaux et al. 2011). 
Life is not only a program; it relies also on other fundamental nongenetic properties, for example molecular 
self-organisation and molecular crowding. 
3.
 
Each part of the genome is loosely connected with the rest: when designing novel constructs or cells one 
should also bear in mind that there are also fundamental questions on nongenetic processes which are not 
defined in a DNA program. A living organism is an open system made  of hundreds of chemical reactions 
whose properties go beyond the DNA program. The assembly of a synthetic cell unfolds the importance of 
physical aspects that are, in vivo, regulated by already evolved gene networks (Noireaux et al. 2011). 
Another way is performing large-scale inactivation studies in order to define which genes are essential for cell 
survival in several well-characterised bacterial models (Escherichia coli, Bacillus subtilis,…) (Moya et al. 2009), 

---