T. C. Ankara universitesi BİLİmsel araştirma projesi kesin raporu


Yöntem 3.2.1. Antosiyaninlerin HPLC ile analiz edilmesi



Yüklə 274,48 Kb.
səhifə2/6
tarix11.06.2018
ölçüsü274,48 Kb.
#47839
1   2   3   4   5   6

3.2. Yöntem

3.2.1. Antosiyaninlerin HPLC ile analiz edilmesi


  • Ekstraksiyon prosedürü: Antosiyaninlerin ekstraksiyonunda Lee and Wrolstad (2004), Chaovanalikit and Wrolstad (2004) ve Skrede, Wrolstad and Durst (2000) çalışmaları baz alınmış ve bir ekstraksiyon yöntemi ortaya konmuştur (Şekil 1). Bu amaçla 10 g incir örneği plastik örnek kabına ± 0,0001 hassasiyetle tartılmış ve üzerine 20 mL % 100 aseton eklenmiştir. 2 dakika boyunca Warring Blender ile orta hızda (3. kademede) homojenize edilmiştir. Parçalanmış meyve kitlesi buchner hunisi kullanılarak whatman 1 nolu filtre kullanılarak vakum altında filtre edilmiştir. Filtre keki tekrardan bu sefer 2. kez 20 mL % 70 aseton ile yine waring blender ile 2 dakika homojenize edilmiş ve yine 10 mL yeni % 70 aseton ile yıkanarak huniye aktarılmıştır. Böylece 2. ekstraksiyon ile filtre üzerindeki kalıntı tamamen renksiz kılınmış tüm antosiyanin içeriği solvente geçirilmiştir. Toplanan filtratlar ayırma hunisine aktarılmış ve üzerine 100 mL kloroform eklenip, 1 dakika boyunca karıştırılmıştır. Bu karışım 1 gece +4 ºC’de bekletilmiş ve keskin bir faz ayrımı sağlanmıştır. Antosiyaninleri içeren renkli üst faz rotary balonuna alınmış, rotary evaporator (Heidolph, Laborota 4003, Schwabach, Germany) yardımıyla 40ºC’de vakum altında aseton uçurulmuş ve asitlendirilmiş su (% 0,01 HCL) 10 mL’ye tamamlanmıştır.

10 g incir mayşesi


20 mL aseton (%100) ekstraksiyon


Filtrasyon (whatman 1 )


Kalıntı % 70 aseton (20 mL) 2. ekstraksiyon
Filtrat toplama (ayırma hunisi)


100 mL kloroform ekleme


karıştırma


+4°C de 1 gece bekletme


renkli faz ayrımı
evaporasyon


hacme tamamlama (10 mL, % 0,01 HCI)

Şekil 1. Antosiyaninlerin ekstraksiyonu


  • Saflaştırma prosedürü: Ekstraksiyon sonucu elde edilen çözelti yalnızca antosiyaninleri içermekte kalmayıp suda çözünen tüm bileşenleri (organik asitler, şekerler, polifenolik bileşenler, flavonoidler) içermektedir. Dolayısyla HPLC’de analizi interfere edecek diğer unsurları elemine etmek için bir saflaştırma basamağına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu amaçla tek kullanımlı C18 Sep-Pak (Waters, Vac 1cc-100 mg) katı faz ekstraksiyon (SPE) kartuşları kullanılmıştır. Saflaştırma işlemi Şekil 2’de gorüldüğü üzere temel 5 basamaktan oluşmaktadır.


Şekil 2. Tipik bir SPE (Solid Phase Extraction) kartuşu



1) İlgili kartuşun seçimi 2) Kolonun şartlandırılması 3) Örneğin yüklenmesi



4) Örneğin yıkanması 5) İgili bileşenlerin ayrılması



○ = matriks = polifenolik bileşik = antosiyanin



  • = solvent A (etil asetat) = solvent B (MeOH)

Şekil 3. Katı faz ekstraksiyonunun temel basamakları
Burada birinci basamak uygun Sep-Pak kartuşun seçimi olmakla beraber ters faz katı faz ekstraksiyonu yapılacağından nonpolar sorbent ile doldurulmuş Waters marka C18 Vac-100 mg tek kullanımlı kartuşlar tercih edilmiştir. Daha sonra ikinci basamakta kartuş sırasıyla 5 mL etil asetat, 5 mL MeOH (%0,01 HCL) ve 2 mL su (%0,01 HCL) ile şartlandırılmışdır. Örneği yüklemeye hazır hale gelen kartuşa 1 mL ekstrakt yüklenmiş ve 4. basamakta 2 mL su ((%0,01 HCL) ile istenmeyen bileşikler (organik asitler ve şekerler) uzaklaştırılırken, antosiyaninler, polifenoller ve flavonoidler kartuş üzerinde tutulmuştur. Arzu edilen bileşikler tutunmuş halde iken kartuş azot altında 3 dakika kurutulmuş ve daha sonra son aşamada 5 mL etil asetat ile polifenoller ve 2 mL MeOH (%0,01 HCL) ile antosiyaninler ayrı ayrı kartuştan alınmıştır. Saflaştırılan polifenol ve antosiyanin ekstraktları azot altında kutulmuş ve % 0,01 su (%0,01 HCL) ile çözündürülmüştür. Bu ekstraktlar HPLC’ye enjekte edilmeden önce 0,45 µm (Millipore, MA, A.B.D.) filtreden filtre edilmiş ve analiz anına kadar -25°C’de depolanmıştır.
HPLC cihazının özellikleri

Bu amaçla Agilent (1200, Waldbronn, Germany) marka binary (ikili) pompa (G-1312A), fotodiyoterey dedektör (G-1315B), termostatlı kolon fırınından (G-1316A), oto örnekleyici (G-1329A) ve degasser (G-1322A)’den oluşan bir HPLC sistemi kullanılmıştır. Elde edilen kromatogramlar ChemStation rev.A.06.03 yazılımı ile değerlendirilmiştir.


Kromatografi koşulları :

  • Kolon : C18 (Ace, 250 mm x 4.6 mm, 5 µm parça iriliği) HPLC kolonu

  • Kolon sıcaklığı : 25°C

  • Çalışma süresi : 30 dakika

  • Teşhis dalga boyu : 280, 320 ve 520 nm’de eş zamanlı belirleme

  • Enjeksiyon hacmi : Standart ve örnekten 50 µL

  • Mobil faz : A: % 100 Asetonitril B: (Fosforik asit/Asetik asit/Asetonitril/Su-1:10:5:84)

  • Akış hızı : 1 mL/dak

  • Akış tipi : Gradient akış söz konusu olup ilgili gradient program aşağıda verilmiştir.

Çizelge 1. Antosiyaninlerin ayrılmasında zamana karşı mobil faz kompozisyonunda elüsyon profili (Lee and Wrolstad 2004*)



Zaman (dakika)

Asetonitril (% 100)

A


Fosforik asit/Asetik asit/Asetonitril/Su-(1:10:5:84) B

0

1

99

10

12

88

20

22

78

25

22

78

26

1

99

30

1

99

* tarafımızdan modifiye edilmiştir

Tanımlama ve kantifikasyon :

Kromatogramlarda elde bileşiklerin tanımlanması;



  • standart maddelerin (cyn-3,5-diglu, cyn-3-glu, cyn-rhamnoglu, pg-3-glu) geliş süreleri örnekteki bileşiklerin geliş süreleri karşılaştırılması,

  • standart maddelerin UV spektrumları örnekteki bileşiklerin spektrumları ile karşılaştırılması (Şekil 4,5 ve 6),

  • standart maddelerin örnek ekstraktına eklenmesiyle gerçekleştirilmiştir.



Şekil 4. Cyn-rhamnoglu UV spektrumunun örnek piki UV spektrumu ile karşılaştırılması



Şekil 5. Cyn-3,5-diglu UV spektrumunun örnek piki UV spektrumu ile karşılaştırılması



Şekil 6. Cyn-3-glu UV spektrumunun örnek piki UV spektrumu ile karşılaştırılması

Antosiyaninlerin tanımlanmasında ticari HPLC saflığında siyanidin-3,5-diglukozit (cyn-3,5-diglu), siyanidin-3-glukozit (cyn-3-glu), pelargonidin-3-glukozit (pg-3-glu) ve siyanidin rhamnoglukozit (cyn-rhamnoglu) kullanılmıştır. Elde edilen bu standart maddeler, floresan ışıktan kaynaklı herhangi bir parçalanma olmaması için 15 watlık kırmızı ışık altında %1 TFA (TriFloroAsetik asit) ile 100 ppm’lik stok çözeltiler hazırlanmıştır. Bu stok çözeltiden uygun seyreltmeler yapılarak bir seri standart seri çözelti hazırlanmış ve aynı kromatografik koşullar altında HPLC’ye enjekte edilmiştir. Herbir bileşenin konsantrasyona karşı alanları baz alınarak kalibrasyon eğrileri çizilmiş ve bu eğrileri ifade eden eşitliklere ulaşılmıştır (Şekil 7, 8 ve 9).


Şekil 7. Siyanidin-3,5-diglukozit standart kalibrasyon eğrisi




Şekil 8. Siyanidin-3-glukozit standart kalibrasyon eğrisi




Şekil 9. Siyanidin rhamnoglukozit standart kalibrasyon eğrisi





Yüklə 274,48 Kb.

Dostları ilə paylaş:
1   2   3   4   5   6




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə