T. C. Ankara universitesi BİLİmsel araştirma projesi kesin raporu


Karotenoidlerin HPLC ile analiz edilmesi



Yüklə 274,48 Kb.
səhifə3/6
tarix11.06.2018
ölçüsü274,48 Kb.
#47839
1   2   3   4   5   6

3.2.2. Karotenoidlerin HPLC ile analiz edilmesi


Karotenoid bileşiklerin analizinde, ilgili gıda maddesi örneğinden bileşenlerin ekstrakte edilmesi yani ilgili solvente kayıpsız olarak transfer edilmesi analizin HPLC’ye enjeksiyon öncesi en önemli basamağıdır. Bugüne kadar bu bileşen üzerine birçok araştırma gerçekleştirilmiş birçok farklı solvent veya solvent karışımları ile ekstraksiyon yöntemleri ortaya konmuştur.
Bu araştırmada karotenoid bileşiklerin analiz edilmesinde, farklı ekstraksiyon yöntemleri, farklı HPLC kolonları (C18 ve C30) ve farklı mobil faz kompozisyonları denenmiştir. Fakat elde edilen kromatogramlarda tam anlamı ile iyi ayrımlar elde edilememiş ve ekstraksiyon yöntemi olarak Hart and Scott (1995) tarafından önerilen yöntem baz alınmıştır. Buna karşın HPLC analizlerinde ise C18 ve C30 gibi farklı kolonlar ile yapılmış araştırmalar incelenmiş ve her iki kolon ile de denemeler gerçekleştirilmiştir. C30 ile yapılan denemelerde daha iyi ayrımlar elde edilmiştir. Yine birçok mobil faz kompozisyonu ile çalışılmış, Rouseff and Raley (1996) tarafından önerilen MeOH, TMBE ve Su’dan oluşan üçlü mobil faz sisteminin en iyi sonuç verdiği saptanmıştır. Bu çalışmada, hem ekstraksiyon yönteminin ortaya konmasında hem de HPLC ayrımlarının elde edilmesinde tercih edilen mobil faz elüsyonlarında baz alınan çalışmalar (Hart and Scott 1995, Rouseff and Raley 1996) bire bir aynı olmayıp incir üzerinde yapılan ilk çalışma olduğu için tarafımızdan modifiye edilerek kullanılmıştır.
Araştırmamızda denemiş olduğumuz yöntemler ve elde ettiğimiz kromatogramlar toplu halde EK1’de verilmiştir.


  • Karotenoidlerin ekstraksiyon prosedürü: Taze incirlerin ekstraksiyonunda Hart and Scott (1995) tarafından önerilen yöntem tarafımızdan modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla taze incir örnekleri yeterli miktarda su içeriğine sahip olmalarından dolayı direkt olarak waring blenderda orta hızda 3 dakika süreyle homojenize edilmiştir. Ekstraksiyon işleminin ilk basamağı olan bu aşama analizlerin tekrarlanabilirliği açısından çok önemli olup yeterli bir parçalanma sonunda homojen bir kitle elde edilmiştir. Homojen kitleden ±0.001 g hassasiyetle yaklaşık 5 g örnek doğrudan santrifüj tüplerine tartılmıştır. Kuruma işlemin uygulanmaya başlandığı örneklerde ise, yeterli su içeriği azalmış ve tekstür sert bir yapıya dönüşmeye başladığı için 20 g incir örneğinin üzerine 20 mL distile su eklenmiş ve bir gece +4°C’de rehidrasyona bırakılmıştır. Rehidre örnekler yine waring blenderda homojenize edilmiş ve ±0.001 g hassasiyetle yaklaşık 5 g örnek santrifüj tüplerine tartılmıştır. Tüplere aktarılmış homojenize örneklerin yapısında doğal olarak bulunan organik asitler karotenoidlerin parçalanmasına neden olacağından bu örnekler üzerine yaklaşık 0.2 g kadar nötralize edici ajan (CaCO3) eklenmiştir. Santrifüj tüplerine 15 mL THF:MeOH (1:1, v/v) karışımından oluşan ekstraksiyon solventi eklenmiştir. Bu karışım bir homojenizatör (Heidolph, SilentCrusher M, Schwabach, Germany) yardımı ile 16.000 rpm’de 1 dakika süre ile ekstrakte edilmiştir. Elde edilen ekstrakt 6000 rpm’de 15 dakika santrifüjlenerek supernatant 50 mL ayrı bir ölçü balonunda toplanmıştır. Kalıntı 2 kez daha aynı şekilde 15 mL THF:MeOH (1:1, v/v) solvent karışımı ile ekstrakte edilmiş ve santrifüjlenerek supernatantlar toplanmıştır. Toplanan supernatantlar ekstraksiyon solventi ile 50 mL’ye tamamlanmıştır (Şekil 10). Elde edilen ekstrakt bekletilmeksizin saflaştırma işlemine tabi tutulmuştur.

5 g taze incir örneği


15 mL THF:MeOH ekleme




1. Ekstraksiyon (1 dak. 16.000 rpm)
santrifüjleme (15 dak. 6000 rpm)
supernatant toplama (50 mL)


15 mL THF:MeOH ekleme


2. Ekstraksiyon (1 dak. 16.000 rpm)


15 mL THF:MeOH ekleme


3. Ekstraksiyon (1 dak. 16.000 rpm)
Hacme tamamlama (50 mL)


Saflaştırma (20 mL ekstrakt)


Sabunlaştırma (1 saat, karanlık ortam)


Susuz sodyum sülfat ile rotary balonuna aktarma


Evaporasyon (35°C)
Kalıntıyı çözme (1:9, THF:MeOH)
Filtrasyon (0.45 µm) ve HPLC’ye enjeksiyon

Şekil 10. Karotenoidlerin ekstraksiyonu



  • Saflaştırma (partition) : Balon jojede hacme tamamlanan karotenoid ekstraktından 20 mL örnek 250 mL ayırma hunisine aktarılmıştır. 20 mL ekstrakt üzerine 20 mL dietileter ilave edilmiştir. Yaklaşık 100 mL %10 NaCI çözeltisi ile ayırma hunisinin duvarlarından yıkanarak faz ayırımı sağlanır. Özellikle bu aşamada karışımda emülsiyon oluşma riskine karşı yıkama işlemi ayırma hunisinin duvarlarından yavaş bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Keskin bir ayrımın oluşması ile tüm karotenoid bileşikler eter fazında toplanması sağlanmış ve alt oluşan sulu faz atılmıştır. Daha sonra karotenoid bileşikleri içeren bu eter fazına 20 mL %10’luk metanolik KOH çözeltisi eklenmiş ve 1 saat boyunca karanlık ortamda tutularak sabunlaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu sürenin sonunda 10 mL %10 NaCI çözeltisi ve 90 mL distile su ile yıkama yapılarak oluşan sabun yapıdan uzaklaştırılmıştır. Elde edilen ekstraktın yapısnda bulunan kalıntı alkali 10 mL distile su ile 3 kez yıkanarak tamamen uzaklaştırılır. Alttaki sulu faz uzaklaştırıldıktan sonra ayırma hunisindeki eter fazı yaklaşık 15 g susuz sodyumsülfat içeren filtre kağından rotary balonuna süzülmüştür (Şekil 11). Ayrıma hunisi, filtre kağıdı eter ile yıkanarak tüm karotenoid bileşikler kayıpsız bir şekilde rotary balonunda toplanmıştır. Elde edilen eter ekstraktı rotary evaporatörde 35°C’de vakum altında evapore edilirek tüm eter uzaklaştırılmıştır. Daha sonra rotary balonundaki kalıntı 200 µL THF ve 1800 µL MeOH ile çözündürülmüş ve 0.45 µm’lik tek kullanımlı şırınga ucu PTFE filtre (Millipore) yardımı ile filtre edilerek HPLC sistemine enjekte edilmiştir (Şekil 10).


Şekil 11. Karotenoid bileşiklerin saflaştırılması



HPLC cihazının özellikleri

Bu amaçla Shimadzu (Kyoto, Japan) marka quertarnary (dörtlü) pompa (LC-20AD), fotodiyotarray dedektör (SPD-M20A), termostatlı kolon fırınından (CTO-10S) ve degasser (DGU-20A5)’den oluşan bir HPLC sistemi kullanılmıştır. Elde edilen kromatogramlar LCsolution yazılımı ile değerlendirilmiştir.


Kromatografi koşulları

  • Kolon : C30 (YMC, 250 mm x 4.6 mm, 5 µm parça iriliği) HPLC kolonu ve yine C30 koruma kolonu (Phenomenex, 10 mm x 4.0 mm, 5 µm parça iriliği),

  • Kolon sıcaklığı : 30°C

  • Çalışma süresi : 62 dakika

  • Teşhis dalga boyu : 440, 450, 460 ve 471 nm eş zamanlı belirleme

  • Enjeksiyon hacmi : Standart ve örnekten 20 µL

  • Mobil faz : MeOH (% 100)-A, Metiltertbutileter (MTBE % 100)-B ve Su (% 100)-C’den oluşan üçlü mobil faz kullanılmıştır.

  • Akış hızı : 1 mL/dak

  • Akış tipi : Gradient akış söz konusu olup ilgili gradient program aşağıda verilmiştir.

Çizelge 2. Karotenoid bileşiklerin ayrılmasında zamana karşı mobil faz kompozisyonunda değişim elüsyonu (Rouseff and Raley 1996*)



Zaman (dakika)

Metanol (% 100)

TMBE (% 100)

Su (% 100)

0

90

5

5

15

95

5

0

20

95

5

0

30

75

25

0

50

50

50

0

52

90

5

5

62

90

5

5

* tarafımızdan modifiye edilmiştir

Standart karotenoid çözeltilerinin hazırlanması

Tüm karotenoid standartları ışığa karşı hassas bileşenler oldukları için çözelti haline getirilirken 15W’lık sarı ışık altında hazırlanmıştır. Bu amaçla 5 mg lutein ve 5 mg β-karoten ilk önce 5 mL kloroform (HPLC grade, %0.1 BHT) daha sonra 45 mL hekzan (HPLC grade, %0.1 BHT) içinde çözündürülmüş ve 100 ppm’lik standart lutein ve β-karoten stok çözeltileri elde edilmiştir. Yine 5 mg zeaksantin 50 mL kloroform (HPLC grade, %0.1 BHT) içerisinde çözündürülerek 100 ppm stok standart zeaksantin çözeltisi elde edilmiştir. β-kriptoksantin stok çözeltisi için ise yine 5 mg standart ilk önce 25 mL kloroform (HPLC grade, %0.1 BHT) ve daha sonra 25 mL hekzan (HPLC grade, %0.1 BHT) içerisinde çözündürülerek 100 ppm çözelti elde edilmiştir. Karotenoid standartları Hart and Scott (1995) tarafından önerildiği şekilde en iyi çözünen solvent ve solvent karışımlarında hazırlanarak stok çözeltiler elde edilmiştir. Fakat bu stok çözeltiler hazırlanırken, çalışılan miktarlar 5 mg gibi çok düşük miktarlar olmalarından dolayı hassas terazide tartım sırasında veya ampül içinde bulunan standart maddeler çözelti haline getirilirken kayıplar meydana gelebilir. Dolayısıyla bu kadar küçük miktarlarla çalışılırken yapılacak küçük bir hata gerçek pigment konsantrasyonlarının hesap edilmesinde yanlış sonuç vermesine neden olacaktır. Bu nedenle hazırlanan 100 ppm’lik stok standart karotenoid çözeltilerinin konsantrasyonları, spektrofotometrede “kesin konsantrasyonları” (exact concentration) saptanmıştır.


Stok karotenoid çözeltilerinin kesin konsantrasyonlarının belirlenmesi

Bu amaçla 100 ppm’lik stok karotenoid standartlarından 1 mL alınıp 10 mL’lik ölçü balonuna aktarılmıştır. Alimünyum folyo ışık geçirgenliği önlenmiş ve azot gazı altında tamamen kurutulmuştur. Elde edilen kalıntılar Çizelge 3’de verilen uygun solventlerde tekrar çözündürülmüş ve hacme tamamlanmıştır. Daha sonra elde edilen çözeltiler maksimum dalga boylarında spektrofotometrede absorbansları okunmuştur. Elde edilen absorbans değerleri uygun absorpsiyon katsaylarına (absorption/extinction coefficient) bölünerek kesin konsantrasyonları saptanmıştır. Hesaplamalarda aşağıda verilen 1 nolu eşitlikten yararlanılmıştır (Konings and Roomans 1997).


Absorbans =Konsantrasyon x Spesifik Absorpsiyon Katsayısı (1)
Çizelge 3. Bazı karotenoid bileşiklerin maksimum dalga boyları (λmax), molekül ağırlıkları (MW), solventler ve spesifik absorpsiyon katsayıları (A1cm%1)

Karotenoid

Solvent

λmax, nm

A1cm%1

A1cmmM

MW

Lutein

Etanol

445

2550

145.1

569

Zeaksantin

Hekzan

451

2480

141.1

569

β-kriptoksantin

Hekzan

451

2460

136.0

553

Likopen

Hekzan

471

3450

185.3

537

α-karoten

Hekzan

444

2800

150.3

537

β-karoten

Hekzan

450

2560

137.4

537

Spektrofotometre yardımı ile saptanan konsantrasyon daha sonra HPLC’ye enjekte edilmiş ve safsızlık unsurları diğer pikler saptanmıştır. Bu safsızlık unsurları dikkate alınarak kesin konsantrasyonlara ulaşılmıştır (Çizelge 4).


Çizelge 4. Karotenoid standartlarının kesin konsantrasyonları

Karotenoid

Hazırlanan konsantrasyon (ppm)

Spektrofotometrede saptanan konsantrasyon (ppm)

Safsızlık yüzdesi (%)

Kesin konsantrasyon (ppm)

Lutein

100

75

2.06

67.58

Zeaksantin

100

72

9.90

70.51

β-kriptoksantin

100

35

6.50

33.08

β-karoten

100

80

4.90

74.52



Tanımlama ve kantifikasyon:

Kromatogramlarda elde bileşiklerin tanımlanması;



  • standart maddelerin geliş süreleri örnekteki bileşiklerin geliş süreleri karşılaştırılması,

  • standart maddelerin UV spektrumları örnekteki bileşiklerin spektrumları ile karşılaştırılması (Şekil 12, 13, 14 ve 15),

  • standart maddelerin örnek ekstraktına eklenmesiyle gerçekleştirilmiştir.

Daha sonra ilgili stok çözeltilerden uygun dilüsyonlar yapılarak bir seri standart çözelti hazırlanmış ve bu çözeltiler HPLC’de analizi yapılarak konsantrasyonlara karşı piklerin alanları saptanmıştır. Elde edilen bu veriler yardımı ile lutein, zeaksantin, β-kriptoksantin ve β-karotene ilişkin kalibrasyon eğrileri ve denklemleri hesaplanmıştır (Şekil 16, 17, 18 ve 19).

Şekil 12. Lutein UV spektrumunun örnek piki UV spektrumu ile karşılaştırılması



Şekil 13. Zeaksantin UV spektrumunun örnek piki UV spektrumu ile karşılaştırılması

Şekil 14. β–kriptoksantin UV spektrumunun örnek piki UV spektrumu ile karşılaştırılması




Şekil 15. β–karoten UV spektrumunun örnek piki UV spektrumu ile karşılaştırılması

Şekil 16. Lutein standart kalibrasyon eğrisi



Şekil 17. Zeaksantin standart kalibrasyon eğrisi


Şekil 18. β–kriptoksantin standart kalibrasyon eğrisi



Şekil 19. β–karoten standart kalibrasyon eğrisi


3.2.3. Nem tayini

İncir örneklerinin nem içeriğinin tayini, vakumlu kurutma dolabında gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, 85 mm çapındaki alüminyum kurutma kaplarına tartılan bu amaçla kullanılmak için hazırlanmış 2’şer g deniz kumu önce kurutma dolabında 110°C’de 2 saat süreyle kurutulmuştur. Daha sonra kum içeren bu kurutma kapları desikatöre alınarak soğutulmuş ve kum+kapak dahil edilerek daraları kaydedilmiştir. Diğer taraftan incir örnekleri yüksek devirli blenderde 3 dakika süreyle homojenize edilmiş ve bu kitleden kurutma kaplarına yaklaşık 5’er g örnek ± 0.001 g hassasiyetle tartılmıştır. Bir miktar damıtık su ilave edilip, tartılan kitle cam baget ile iyice ezilerek tamamen homojen bir hale getirilmiş ve baget kuruma kabına yıkanarak geri alınmıştır. Elde edilen homojen kitle ilk önce 90°C’de su banyosunda (Memmert ULM 500, Schwabach, Almanya) kurutma kabındaki suyun önemli bir kısmının uzaklaşması sağlanmış ve sonra vakumlu kurutma dolabına (Heraeus VT 6025, Hanav, Almanya) yerleştirilmiştir. Örnekler burada 70°C’de ve 100 mm Hg basınç altında sabit ağırlığa gelinceye kadar kurutulmuştur. Kurutma işlemi yaklaşık 12 saat sürmüş ve bu süre boyunca devamlı olarak sülfürik asit çözeltisinden saniyede 2 kabarcık geçecek şekilde taze kuru hava verilmiştir. Kurutma işleminin sonunda kurutma kapları desikatöre alınmış ve burada soğutulduktan sonra tartım yapılmıştır. Yapılan tartımlardan, örneklerdeki yüzde nem miktarı ve toplam kuru madde içeriği hesaplanmıştır. Tanımlanan bu yöntemle nem tayininde, A.O.A.C. (2000) tarafından önerilen 930.04. No’lu yöntem izlenmiştir.



3.2.4. Pomolojik özellikler

Materyal olarak kullanılan incirlerin en, boy, sap uzunlukları kumpas ile ölçülerek, ağırlıkları ise 0.01 duyarlıktaki hassas terazide tartılarak belirlenmiştir. Bu amaçla her bir incir örneğinden 10 adet kullanılmış olup her çeşitten 2 tekerrür gerçekleştirilmiştir.



3.2.5. Renk ölçümleri

Bu amaçla, reflektans kolorimetrisi (Minolta Cr-300, Osaka, Japonya) kullanılmıştır. Kolorimetre, standart beyaz seramik plaka (L = 97.26, a = + 0.13, b = + 1.71) ile her kullanımdan önce standardize edilmiştir. Dört noktadan okuma yapılarak Hunter L*, a*, b* ve h° değerleri saptanmıştır.



IV. ARAŞTIRMA BULGULARI

4.1. Bursa siyahi, Morgüz ve Yeşilgüz incir çeşitlerinin antosiyanin içerikleri

Bilindiği üzere meyve ve sebzelerin antosiyanin içerikleri çeşit, tür, yetiştirme koşulları ve olgunluk gibi birçok faktöre bağlı olarak değiştiği bilinmektedir. Bu araştırmada seçilen çeşitler, İncir Araştırma Enstitüsü tarafından yetiştiriciliği yapılan yaygın ve yoğun renkli olanlar tercih edilmiştir. Bu amaçla Bursa siyahi, Morgüz ve Yeşilgüz incir çeşitlerinden 2 yıl tekrarlı örnek alınmıştır. Bu çeşitlere ilişkin antosiyanin kompozisyonu gösteren tipik bir HPLC kromatogramı Şekil 20, 21 ve 22’de verilmiştir. Şekillerden görüleceği üzere tüm örneklerde, siyanidin-3,5-diglukozit (1 nolu pik), siyanidin-3-glukozit (2 nolu pik), tanımlanamayan ana bileşen (3 nolu pik) ve iz miktarda pelargonidin-3-glukozit (4 nolu pik) saptanmıştır.



Şekil 20. Bursa siyahi incir çeşidinin antosiyanin kompozisyonu; 1: siyanidin-3,5-diglukozit, 2: siyanidin-3-glukozit, 3: tanımlanamayan ana bileşen, 4: pelargonidin-3-glukozit



Şekil 21. Morgüz incir çeşidinin antosiyanin kompozisyonu




Şekil 22. Yeşilgüz incir çeşidinin antosiyanin kompozisyonu


Siyah incir çeşiti üzerine bugüne kadar yalnızca Puech et al (1975) tarafından yapılmış olup bu çalışma yalnızca tanımlamaya yönelik kalitatif bir araştırma niteliğindedir. Puech et al (1975) bu çalışmada Misssion çeşidi siyah incir örneğinde %75 oranında siyanidin-3-rhamnoglukozit, %11 siyanidin-3,5-diglukozit, %11 siyanidin-3-glukozit ve %3 pelargonidin-3-glukozit belirlemişlerdir. Yoğun mor-kırmızı renkleri nedeniyle incelediğimiz çeşitlerin hepsinde antosiyanin kompozisyonunun yaklaşık %80.00-88.60’ni tanımlanamayan ana bileşen, %5.35-12.88’nü siyanidin-3,5-diglukozit, %6.04-9.70’nü siyanidin-3-glukozit oluşturduğu görülmüştür (Çizelge 5). Bu araştırmada Puech et al (1975)’in çalışmasından yola çıkılarak ana bileşenin siyanidin-3-rhamnoglukozit olduğu düşünülerek siyanidinrhamnoglukozit (Apin Chemicals, 44171c) antosiyanin standardı temin edilmiştir. Fakat HPLC analizlerimiz sonucunda elde edilen kromatogramda ana bileşenin geliş zamanı ile standart siyanidinrhamnoglukozit’in geliş zamanlarının aynı olmadığı görülmüştür. Şekil 23’den de görüleceği üzere ana bileşene ait pikin geliş zamanı 7.62 (dakika) iken standart siyanidinrhamnoglukozit’in geliş zamanı 9.97 (dakika) olduğu saptanmıştır. Geliş zamanlarının uyumlu olmamasına karşın, standart siyanidinrhamnoglukozit’in UV spektrumu tanımlanamayan bileşenin UV spektrumu ile bire bir aynı olduğu görülmüştür (Şekil 4). Tanımlayamadığımız ana bileşenin miktarsal ifadesinde standart siyanidinrhamnoglukozit’in kalibrasyon eğrisinden yararlanılmıştır.

Çizelge 5. Bursa siyahi, Yeşilgüz ve Morgüz çeşitlerinin bileşen oranları


Çeşit

cyn-3,5-diglu

(%)


cyn-3-glu

(%)


Tanımlanamayan ana bileşen

(%)


Bursa siyahi

5.35

6.05

88.60

Yeşilgüz

6.67

9.70

83.61

Morgüz

12.88

7.12

80.00

Yüklə 274,48 Kb.

Dostları ilə paylaş:
1   2   3   4   5   6




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə