Temel Prensipler
Yüklə 126,76 Kb.
|
|
BİYOKİMYADA SPEKTROSKOPİK TEKNİKLER M.Koray GÜMÜŞTAŞ, İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Fatih-İSTANBUL Işık, Madde ve Radyan Enerjinin Özellikleri. Işık elektromanyetik bir enerjidir ve büyük bir hıza sahiptir. Biz görünür ışığı gözle, infrared ışınları-UV ışınları ise ısı şeklinde algılarız. Işın yayan bu elektromanyetik enerjinin bir dalga boyu ( λ, nm) ve saniyede tekrar etme sayısı olan bir frekansı ( ν ) söz konusudur. Bu özellikler ışık hızıyla orantılıdır.  c : ışık hızı (vakum ortamında, 33x1010m / sn)
V = λ : dalga boyu (nm , 10-9 m) ν : Frekans (saniyedeki siklüs / döngü) Yayılan ışın enerjisi en küçük bileşen olarak foton dediğimiz taneciklerden oluşmuştur. Fotonların enerjisi tamamen yayılan ışığın frekansına (ν) veya dalga boyuna (λ) bağlıdır. Fotonun enerjisi (E) ve frekansı arasındaki ilişki aşağıdaki gibi formüllendirilir.  E = Enerji (erg)
E = hν veya E = h ; Plank Sabiti (6.62x1027 erg.sn) Bu formülden anlaşılacağı gibi, kısa dalga boylarında fotonlar yüksek dalga boyuyla kıyaslandığında, daha yüksek enerjiye sahiptirler. Elektromanyetik spektrumun geniş alanları ve dalga boyu ile ilişkisi aşağıda tablodaki gibidir.
Gamma X Ultraviole Görünür Kızıl ötesi Mikrodalga Işınları Işınları Bölge(UV) Bölge (IR) Bölge
Dalga 0,1 1 180 390 780 400x103 Boyu (nm)
Tablo I: Elektromanyetik Spektrumunda Başlangıç Değerleri Güneş ışığı veya tungsten filamandan yayımlanan ışın değişik dalga boylarının karışımı olan ve beyaz renkli olarak gördüğümüz bir enerjidir. Bu görünür bölgedeki ışının absorblanan ve yansıtılan renkleri ayrıldığında aşağıdaki dalga boylarına göre dizilim oluşur.
Şekil 1: Dalga boylarına göre frekanslar ve ışık tayfı Buna göre tanımlanan ışık 430-480 nm mavi bölgede absorbsiyon yapan bir çözeltiden geçirilirse diğer renkleri geçirir ve gözümüze sarı gözükür. Bundan dolayı sarı rengin, mavinin tamamlayıcı rengi olduğu kabul edilir. İnsan gözü 390-780 nm dalga boyu aralığındaki ışıklara tepki verip değerlendirme yaparken, laboratuvar aletleri daha düşük dalga boylarından UV ve büyük dalga boylarında örneğin kızıl ötesi (IR) bölgede ölçüm yapabilmektedir. 
Şekil 2: Absorbansların dalga boyları ve tamamlayıcı renkleri. Işığın Madde ile Etkileşimi: Bir foton bir atomla, iyonla veya molekülle etkileştiğinde eklenen bir uyarılma enerjisi söz konusudur ve uyarılma enerjisi dalga boyuna bağlı olarak molekülde bazı değişimlere neden olur ki bu değişimler aşağıdaki tabloda toplanmıştır. Işık dalga boyu (nm=10-6m) Işığın türü Maddeyle etkileşimi 0,1> Gamma Çekirdeksel geçiş olayları 1> X1 Işım İç kabuk elektronik geçiş 180> Ultraviole İyonizasyon 390> Görünür bölge Valens Elektronlarda uyarım 780> Kızılötesi (Infrared) Kovalent bağlarda titreşim 400x103> Mikrodalga Dönme ve elektron spin 100 cm> Radyo dalga Çekirdek Spin uyarımı Tablo II: Uyarım enerjisine bağlı çekirdek ve elektron olayları. Yukarıdaki tablodan da görüldüğü gibi uyarılma dalga boyu kısaldıkça molekülün kovalent bağlarından başlayarak dönme ve titreşimler, daha sonra elektronik geçişler ve en son yüksek enerjili uyarılmalarda çekirdek olaylarına kadar değişimler gözlenmektedir. Burada enerjinin olduğu kadar moleküle özgü bağların karekteristikleri de absorplamada önemlidir. Bu nedenle bir çok molekül sahip oldukları bağlardan dolayı farklı elektronik absorpsiyon Bu bantlar molekülün kalitatif tanımlanmasında önemlidir. 
Şekil 3: Elektronik Geçişlerin Enerji Seviyeleri ve Etkileri Bunun gibi elektromanyetik ışığın madde ile etkileşimi yalnız absorpsiyon veya emisyon olarak değil, çoğu zamanda ışığın kırılması, yansıması (refraktometri), saçılması (nefelometri), polarizasyonu (polarimetri), veya elektron koparılması veya farklı ışın oluşumuyla da sonuçlanabilir. Bunlar daha sonra tek tek inceleyeceğimiz yöntemlerin prensiplerini oluşturacaktır. Bu bölümde sıkça kullanılacak olan “spektrum” kelimesi şöyle tarif edilebilir. Elektromanyetik ışının madde ile etkileşmesi sonucu, şiddetlerindeki azalmanın yada maddenin saçtığı yeni ışınların şiddetlerini elektromanyetik ışığın dalga boyuna, sayısına ya da frekansına karşı çizilen değişim eğrilerine spektrum denir. Foton ile uyarılma 10-8 sn gibi kısa zamanda olmakta, uyarılan elektronların büyük kısmı, kısa sürü içerisinde temel hale dönüp, tekrar uyarılmakta ve sürekli soğurma bu şekilde oluşmaktadır. Soğurma atomal düzeyde ise (örn. Sodyum Soğurması) soğurma bandı keskindir ve belirgin frekanslardadır. Yani o atama özgündür. Buna atomal soğurma denir. Fotonların uyarılma enerjisi yalnız elektron uyarımında kullanılır ve grafikte keskin pik oluşturur. Bu nedenle, E uyarma = E elektronik. Bir molekülün yapısında birden fazla atom ve bağ oluşumu söz konusu olduğundan foton enerjisi farklı uyarımlarda kullanılır ve toplam enerji bu uyarımların toplamıdır. Buna molekülsel soğurma denir ve genellikle grafiklerde yaygın bir pik oluşumu söz konusudur. Aşağıdaki şekillerde hem atomal hemde molekülsel soğurmaya örnek gösterilmiştir. E uyarma = E elektronik + E titreşim + E dönme + E vs.   Şekil 5: 242 nm de molekülsel soğurma
ABSORPSİYON SPEKTROSKOPİSİ Bir çözeltiden belli dalga boyunda elektromanyetik ışık geçirildiğinde çıkan ışığın şiddetinde bir azalma olur. Burada giren ışık şiddeti Io , çıkan ışık şiddeti I ise, I/Io oranı Transmittans olarak adlandırılır. Genellikle yüzde transmittans kullanıldığından Tranmitans (T) = I / Io → Transmittans (%T) = 100 x T olarak ifade edilir. Transmittans ölçümleri, çözeltinin farklı konsantrasyonları için yapıldığında lineer olmayan hiperbolik bir eğri çıkar. Böyle bir eğride hesap zorluğu göz önüne alınarak, %Transmittans ın eksi logaritması alınarak, Absorbans (optik densite) dediğimiz, lineer bir ifadeye dönüştürülür.
A = log 1 / T x = log A = log %100 - log % T A = 2 - log % T Bu nedenle Absorbans Skalası 0 - 2.0 arası değişir. Absorbans, Lambert-Beer kanunu ile matematik olarak en iyi ifade edilmiştir. Buna göre Absorbans, çözeltinin karakteristikleri, ışık yolu ve çözeltinin konsantrasyonu ile lineer ilişkilidir. Transmittans ise logaritmik (hiperbolik) bir grafik ilişkisi gösterir.  
Şekil 7: Transmittans-konsantrasyon grafiği A = ε . l .c A; Absorbans (optik densite) ε; Ekstingsiyon katsayısı, molar absorptivite (cm / mol) l; ışık yolu (cm) c; konsantrasyon (mol / L) Bu ifadeyle, absorbans ölçümüyle çözeltideki analitlerin kantitatif analizi mümkündür. Lambert-Beer kanunun çalışma sınırları vardır. Aşağıdaki kurallara uyulması gereklidir.
oluşumu gereklidir).
Tek Işık Yollu Spektrofotometreler Tek ışık yollu spektrofotometrenin temel bileşenleri şematik olarak aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Bunda bir ışık kaynağı giriş yarığından geçtikten sonra bir monokromatör tarafından uygun dalga boylarına ayrılır. Daha sonra uygun dalga boyundaki ışık çıkış yarığından absorbsiyon hücresine (küvet) düşürülür.Radyant enerjinin bir bölümü çözeltinin doğasına ve konsantrasyonuna bağlı olarak bu küvette soğurulur. Soğurulmadan geçen ışık enerjisi dedektör tarafından algılanıp kaydedicide digital olarak sergilenir. Uygulamada reaktif körü içeren çözelti spektrofotometreye yerleştirilip sıfır absorbansa ayarlanır. Sonra sırasıyla varsa reaktif körü ve bilinmeyen çözeltilerin absorbans değerleri ölçülür. Kıyaslama yöntemiyle hesap yapılır 
Çift Işık Yollu Spektrofotometreler. Aşağıda şematik olarak gösterilen çift ışık yollu spektrofotometrelerde tek kaynaktan üretilen ışık enerjisi dalga boyu ayarlayıcı bir sistemden geçtikten sonra bir ayna yardımıyla iki giriş yarığından iki özdeş aynı dalga boyunda çıkan ışınlar aynı örnek ve referans küvetine düşürülür. Işık şiddetindeki azalma aynı anda iki farklı dedektör tarafından algılanır. Kıyaslanan ışık enerjisi kaydedilip digital olarak sergilenir. Bu yolla dedektörün ışık kaynağındaki değişimleri ve duyarlılık değişiklikleri anında değerlendirmesi sayesinde güvenli bir okuma yapılmış olur. 
Spektroskopi Aletlerinin Bileşenleri: Spektroskopi aletlerinin temel bileşenleri ve bunların farklı spektral tekniklere göre alternatifleri aşağıdaki gibi özetlenebilir.
IŞIN SAÇILMA SPEKTROSKOPİSİ Türbidimetri Işık saçılımı, ışığın çözelti içindeki tanecikler ile etkileşimi sonucuyla oluşan fiziksel bir olaydır. Saçılan ışık floresans yayılmadan farklı olarak, gelen ışık ile aynı frekanstadır. Türbidimetri saçılan ışığın ışık şiddetindeki azalmayı ölçen bir tekniktir. Cihaz dizaynı düşünüldüğünde çoğu zaman spektrofotometreye benzer. Fakat ölçüm küvetinde spektrofotometreden farklı olarak saçılmaya sebep olacak süspansiyon halindeki partikül söz konusudur. Bu nedenle bir ışık saçılım tekniği olan tirbidimetride analizlenen tanecik büyüklüğü dalga boyunun derecesi gözlem uzaklığı, gelen ışığın polarizasyonu taneciklerin konsantrasyonu, taneciklerin moleküler ağırlığı önem kazanmaktadır. Işık saçılımının konsantrasyon ve moleküler ağırlık arasında ilişkisi aşağıdaki formülde ifade edilebilir.  = 
İs = Polarize ışıkla uyarılmış küçük taneciklerden saçılan ışık şiddeti Io = Gelen ışık şiddeti dn/dc = Çözgen kırma/refraktiv indeksinde, çözünmüş konsantrasyonundaki değişimine bağlı gözle değişim. M = Moleküler ağırlık (g/mL) C = Tanecik konsantrasyonu (g/mL) Ө = Gözlem açısı Na = Avogadro sayısı Λ = Gelen ışığın dalga boyu r = Işık saçılılımının dedektöre uzaklığı Tanımlanan bu formülden özellikle ışığın gelme yönünden farklı açıyla ölçüm yapan nefelometrelerde süspansiyon taneciğin konsantrasyonu ve molekül ağırlığı hakkında nicel ve nitel analiz yapmak mümkündür. Işık saçılımı tanecik büyüklüğü ve ışığın dalga boyundan etkilenmektedir. Buna göre üç tip temel saçılma aşağıdaki şekilde tanımlanmıştır.
Türbidimetride, spektrofotometrik ölçümdeki duyarlılığı sınırlayıcı etmenler yanında background saçılması ve körün olmamasından önemli derecede etkilenir ayrıca saçılmanın yeterli sinyal oluşturmaması da önemli bir dezavantajdır. Bu nedenle uygun dalga boyu, ışık şiddeti ve uygun konsantrasyonda partikül hazırlanması tayin zamanın iyi belirlenmesi önemlidir. Şematik olarak türbidimetri aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Nefelometride ise temel fark aşağıda şekillerde görüldüğü gibi ışığın gözleme (ölçüm) açılarıdır. 
Şekil 17: (a) Türbidimetri, (b) Nefolometrinin şematik diyagramı. 
Geçen Işık Absorpsiyon Saçılma Kırılma Saçılma
Kırılma
Nefelometri Spektroskopisi Türidimetride anlatılan saçılan ışık, tanecik büyüklüğü ve uygun dalga boyu seçimi nefelometri içinde geçerlidir. Aşağıdaki şemada görüldüğü gibi türbidimetriden farklı olarak nefelometride saçılan ışık, ışığın geldiği doğrultudan farklı açılarda (0-90o) ölçülmesi söz konusudur. 
300 nm ‘de protein ve 400-425 nm’de porfirin absorpsiyonu göz önüne alındığında genellikle nefelometrik analizlerde 320-380 nm ve 500-650 nm dalga boylarında cihazların ölçüm yapması uygundur. Dilüsyon yaparak protein konsantrasyonunun azaltılması antijen tayinlerinde yüksek affiniteli antikor kullanımı, duyarlılığı arttırıcı faktörlerdir. Bu yolla kinetik ve son nokta analizlerine hem türbidimetri hemde nefrelometri uygundur. En çok 250-1500 nm çapındaki antijen-antikor komplekslerinin belirtilmesinde günümüzde sıklıkla kullanılmaktadır. Refraktometre Spektroskopisi I  şık az yoğun ortamdan çok yoğun ortama girdiğinde sınır yüzeyinde bir kırılmaya maruz kalır. Birinci ortamdaki hızı ile ikinci ortamdaki hızı arasındaki oran kırılma indeksi olarak tanımlanır. Havanın kırılma indeksi ise 1 kabul edilir. Kırılma indeksi, ışığın girdiği ortama dik kabul edilen normal çizgisine göre geliş açısı ve ikinci ortamda kırıldıktan sonra normal çizgisiyle yaptığı açıların oranı ile tanımlanır. Aşağıdaki şekilde ışığın kırılması şematize edilmiştir. Şekil 20: Işığın az yoğun ortamdan çok yoğun ortama doğru kırınımı. Sıvı çözgenlerde kırılma gelen ışığın dalga boyuna, sıcaklığına, sıvının özelliğine ve sıvıda çözünen analitlere bağlıdır. Eğer ilk üç tanımlanan faktör ölçümde sabitlenir ise kırılma indeksi çözgende çözünen analit konsantrasyonuyla ilişkilidir.Aşagıdaki eşitliklerden analitin konsantrasyon tayini yanında,molekül büyüklüğüde tayin edilebilir.
n = c/v
Sini / Sinr = V1 / V2 = n1 / n2
n: kırılma indisi, c: Işık hızı v: Işığın ortamdaki hızı V1: Işığın 1. ortamdaki hızı V2: Işığın 2. ortamdaki hızı n1: 1. ortamın kırılma indisi n2: 2. ortamın kırılma indisi R = (n2-1). M / (n2+2).d
Şekil 21: Tanımlanan bu ifadeden önce standart çözeltilerle daha sonra analizlenecek numunelerle yapılan tayinlerden proteinlerin elektrolitlerin ve küçük moleküllü organik yapıların birçok biyolojik sıvıda kantitatif analizin yapılması mümkündür. Bu amaçla sıklıkla kullanılan Abbe refraktometresi aşağıdaki şekilde gösterilmiştir.
[α] = [α] [α] = özgül çevirme açısı, α = gözlenen çevirme açısı, c = g / mL cinsinden derişim l = desimetre cinsinden tüpün uzunluğu (1 dm = 10 cm), [α] çizgisinin 589.6 nm ışık kaynağında ve 250C’de numunenin bir g/mL’si için özgül çevirme açısı
Şekil 22: Polarimetrinin şematik görünüşü ve dönme açılarının gözlemlenmesi. Alev-Emisyon Spektrofotometrisi Birçok metal elementin atomlarına sıcak bir alevdeki gibi yeterli düzeyde enerji verildiğinde (yaklaştığında) elemente karakteristik olan dalga boylarında bu enerji yayılmaktadır (emisyon). Alev etkisiyle elektronlar tarafından belirli miktarda termal enerji soğurulmaktadır. Elektronlar bu yüksek enerji (uyarılmış)düzeyinde kararlı olmadıklarından, uyarılmış düzeyden temel düzeylerine geri dönerken, fazla enerjiyi belirli dalga boylarına karşılık gelen fotonlar olarak serbestleştirmektedirler. Bu geçiş olayları aşağıdaki şekilde gösterilmiştir.  A+ + e- A0
(Isı Uyarım) A0 + hν A* (Uyarılmış)
A* A0 + hν (Ölçülen Işıma)
Enerji eğer ışık olarak harcanıyorsa, bu ışık bir ya da daha fazla enerji düzeyine sahip olabilir ve dolayısıyla değişik dalga boylarında olabilir. Bu çizgi spektrumları her element için karakteristiktir. Örneğin sodyum, birincil olarak 589 nm’de enerji yayar (sarı ışıma). Bir elementin ölçümünde kullanılacak olan dalga boyunun seçimi, yeterli duyarlılığı verebilecek şiddette bir çizginin belirlenmesinin yanı sıra, seçilmiş ya da ona yakın dalga boylarında interferans yapabilecek çizgilerin bulunmaması gibi faktörlere bağlıdır. Bu teknik eskiden kullanılmakta idiysede, şimdilerde büyük ölçüde elektrokimyasal teknikler ve Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi daha sık kullanılmaktadır. Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi (AA) periyodlar cetvelindeki birçok pozitif iyonun tayininde ve özellikle eser elementlerin tayininde hem tıpta hem sanayide yaygın olarak kullanılır. AA spektrofotometrisinde, element alevde çok fazla uyarılmamakta ve yalnızca kimyasal bağları çözülerek uyarılmamış, temel haline dönüştürülmektedir. (nötral atom). Böylece, nötral atom, kendi çizgi spektrumuna karşılık gelen radyasyonu soğurma açısından uygun olan düşük-enerji düzeyinde bulunmaktadır. Analiz edilecek materyal için spesifik dalga boyunda bir ışık üretmek amacıyla katotu aynı materyalden yapılmış, oyuk-katot lambası kullanılmaktadır. Bu şekilde, eğer katot sodyumdan yapılmışsa, lambadan çoğunlukla 589 nm’de sodyum ışığı yayılmaktadır. Lambadan çıkan ışık aleve girdiğinde, bir kısmı alevdeki temel-hal atomları tarafından soğurulmakta ve lambadan çıkan ışının şiddetinde net bir azalma oluşmaktadır. Bu karekteristik dalga boyundaki radyal enerjinin ışın şiddetindeki azalma, alevde uyarılmış atom sayısı ile yani tayin edilen analitin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Lambert-Beer kanuna uygun olarak ölçülen absorbsiyondan konsantrasyon hesap edilebilir. 
a) b)
Bu işlem absorpsiyon spektrofotometrisine analogdur. Işık kaynağı olarak spesifik oyuk-katot lambası kullanılmakta ve küvetteki örnek yerine alevde ısıtılan örnek geçmektedir. Alevin ışık yolu küvetin ışık yoluna analogdur. Önceden tanımlandığı gibi, alevdeki örneğe sadece küçük bir fraksiyonu emisyon enerjisine katkıda bulunmaktadır ve bunun sadece bir fraksiyonu detektöre iletilmektedir. Böylece, atomların çoğunluğu temel halde olup katot lambasından gelen ışığı soğurma kapasitesine sahiptirler. Genelde, AA yöntemleri alev-emisyon yöntemlerine göre 100 kat daha duyarlıdırlar. Buna ek olarak, oyuk-katot lambasında üretilen ışık dalga boyunun emsalsiz özgünlüğüne bağlı olarak, bu yöntemler ölçülen elementler için yüksek özgünlük gösterirler. FLORESANS – FOSFORESANS SPEKTROSKOPİSİ ve KEMİLÜMİNESANS - 1667 R. Boyle ” Cool Light ” - 1877 Radziszewsky kimyasal maddelerle lüminesans oluşturmayı ilk başaran. - 1928 Albrecht Lüminol’ü H2O2 ile okside ederek, lüminesans oluşturmuştur. - II. Dünya Savaşında Japon askerler harita okumada Crustaceans ekstratı kullandı. - 1947 Ateş böceğinin lüminesansı “lüsiferaz” enzim katalizi ile. - 1952 Strehler - Totter “ ATP ” tayini - 1976 Schoeder “ Biyotin ” tayini. Neden Kemilüminesans ? 
Şekil 26 : Çeşitli tekniklerin tayin duyarlılık sınırları Işık enerjisinin küçük bir bölümünün bir molekül tarafından soğurulması bir elektronun temel durumdan mümkün olabilecek uyarılmış titreşimli düzeylere geçmesine neden olur. Uyarılmış düzeye geçen bir molekülün başlangıç durumuna dönmesi için bir çok alternatif söz konusudur. Bu geçişlere ilişkin olaylar sonucunda floresans ve fosforesans olayları oluşabilir. Temel halde iki elektron bir orbitalle karşıt spinli olarak yerleşmiştir. Bu duruma temel singlet hal (S) denir. Bu elektronlar ışın enerjisi ile uyarıldığında daha üst enerji seviyelerinde uyarılmış singlet halde yine zıt spinli bulunabileceği gibi, uyarılmış triplet hal (T) dediğimiz benzer spinde bulunma ihtimalide söz konusudur. Bu spin değişiklikleri aşağıda gösterilmiştir. 
Şekil 27: Uyarılmış moleküllerde singlet ve triplet konumu B Şekil 28: 1)Soğurma 2)Fluoresans 3)Dış dönüşüm 4)Titreşim geçişi 5)İç dönüşüm 6)Fosforesans geçişler
Şekil 29: Florometre Ölçüm düzeneği Genellikle 250-600 nm ışık veren kaynaklar kullanılır. Ölçüm düzeneği spektrofotometreye benzemekle beraber ışık numuneye düştükten sonra geldiği doğrultudan 300-900 de ve belli dalga boyunda ışıma ile oluşan ışık değerlendirilir. Enzim amplifiye lüminesans yönteminde ışıma enzim aktivitesi ile ilişkili olarak dakikalarca sürebilir. Buna karşılık kemilüminesans yönteminde akridinium ester ışıması çok kısa bir an sürer (1 sn) ve flash patlamasına benzer bir ışıma olarak tanımlanır. Kısa sürede yüksek ölçüm verimliliği sağlar.
Şekil 30: Enzimatik lüminesans yöntemi ile serumda PSA tayini. 
Şekil 31: Dioksetan fosfat lüminesans maddesi ile ALP tayini. Şekil 32: ATP tayininde kullanılabilecek ateşböceği lüminesans modeli.
Şekil 33: pH ve H2O2 konsantrasyonuna bağımlı akridinium esterlerinin ışıması. 
Şekil 34: Bazı floresans veren moleküllerin yapıları Yüklə 126,76 Kb. Dostları ilə paylaş:
|
= + 3,120
u farklı iki haldeki uyarılmış molekülün yayın biçimi de farklıdır. Ayrıca singlet-singlet geçişleri singlet-triplet (yada karşıtı) geçişlerinden çok daha kolaydır. Bu nedenle singlet-singlet geçişi kısa ömürlüdür ve floresans ışıması ile sonuçlanır. Buna karşılık triplet-singlet geçişleri daha uzun sürelidir ve fosforesans ışıması ile sonuçlanır. Bir moleküldeki uyarmalar ve bu uyarmaların hangi yollarla sonlandığı Jablonski diyagramı ile çizgilendirilmiştir.
