The Impact of Intensive Fish Farming on Pond Sediment Microbiome and Antibiotic Resistance Gene Composition

Supplementary Table 1
).
Microbiome Analysis
Sequencing
The composition of the bacterial community was determined by
next-generation sequencing (NGS) by scanning the amplicons
of the bacterial 16S rRNA gene. The V3–V4 16S rRNA regions
were chosen for sequencing because they are capable to detect
both bacterial and archaea taxons with high resolution (
24
,
25
).
NGS was performed by Novogene Bioinformatics Technology
Co., Ltd. (Beijing, China) on Illumina paired-end platform to
generate 250 base pairs (bp) length paired-end raw reads.
16S rRNA Data Analysis
The reads were demultiplexed. Barcode and primer linker
sequences were removed using “cutadapt” tool (
26
). The
following steps were performed in QIIME2 (version 2020.11)
(
27
). Data were denoised using read quality scores, low-quality
part at the end of reads was trimmed (227 bp were left in forward
and 224 bp in reverse reads), paired-end reads were merged and
chimeras were removed using the pipeline that includes DADA2
algorithm (
28
). The result of DADA2 pipeline was amplicon
sequence variants (ASV). Phylogenetic trees were created using
MAFFT sequence alignment (
29
) and FastTree tree generation
(
30
). Taxonomic, alpha and beta diversity analyses were based
on ASV’s. Taxonomic annotation was assigned by using pre-
fitted Scikit-learn (
31
) based taxonomy classifier trained on full
16S gene (available at https://data.qiime2.org/2020.11/common/
gg-13-8-99-nb-classifier.qza) based on Greengenes database
(v13_8) at 99% threshold (
32
)
via
QIIME 2’s “q2-feature-
classifier” plugin (
33
). Core alpha and beta diversity metrics were
generated with rarefaction depth equal to the lowest feature count
of a single sample (
34
). Jaccard index was used as a measure of
beta diversity.
Antibiotic Resistance Gene Detection
Genes, commonly found in the clinically important bacteria and
conferring resistance to the different classes of antibiotics used
in the human and veterinary medicine, were included in the
Frontiers in Veterinary Science | www.frontiersin.org
4
May 2021 | Volume 8 | Article 673756

---

Lastauskien ˙e et al.
Fish Farming Microbiome and Resistome
study. In addition, ARGs, previously found in the environmental
samples were also screened. The presence of genes encoding
antibiotic resistance determinants was assessed by PCR at the
same conditions as described earlier (
35
). The genes tested and
specific primers used are described in