The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

79 
Chapter III 
Measuring  DM  catalyzed  peptide  exchange  of  both  MHC II/peptide  complexes  by 
FP  in  the  presence  of  fluorophore-labeled  MBP  peptide  and  comparing  again  initial 
exchange rates, DM catalyzed peptide exchange was 11.8-fold slower when DR2/MBP 
rather than DR2/CLIP was used as the input protein in the reaction (figure 4.2, B).  
As can be seen, the kinetics of DM binding and DM catalysis for low-affinity versus 
high-affinity DR/peptide complexes agree very well indicating data obtained by the DM 
binding assay have strong functional significance and can be related to DM activity.  
 
4.4
 
Conclusion 
In  these  studies  temperature-dependent  DM  binding  was  demonstrated  to  high-
affinity  MHC II/peptide  complexes  previously  exhibiting  no  or  only  little  DM 
susceptibility.  Surface plasmon resonance  experiments  at  37 ºC showed increased DM 
binding to DR2/MBP and interestingly also definitive DM binding to DR1/HA, which 
was previously believed to be resistant to DM action (Kropshofer et al., 1996; Sloan et 
al., 1995). The presented data support the model of a common transient MHC II/peptide 
conformation  for  high-  and  low-affinity  MHC II/peptide  complexes  dependent  on 
kinetic  parameters  and  more  abundant  at  higher  temperature.  Furthermore,  the  data 
assist  the  hypothesis  that  increased  peptide  mobility  may  be  necessary  for  initial  DM 
binding  as  stated  previously  (Anders  et  al.,  2011).  The  functional  relevance  of  the 
applied  DM  binding  assay  was  demonstrated  by  comparing  SPR  data  with  FP 
experiments  measuring  DM  activity.  Comparing  initial  rates  of  DM  binding  and  DM 
catalysis  of  a  low-  and  a  high-affinity  MHC II/peptide  complex  revealed  high 
congruence. Showing that data obtained by the DM binding assay can be related to DM 
activity was important to demonstrate the functional relevance of the results.  
Generation of high-affinity MHC II/peptide complexes in vivo is important for long-
term presentation of MHC II/peptide complexes on the cell surface  which is necessary 
for  multiple  T  cell  encounters.  Here  we  show  that  DM  can  bind  to  high-affinity 
MHC II/peptide complexes and also exchange high-affinity peptides. However, we also 
demonstrate  that  DM  interaction  with  high-affinity  MHC II/peptide  complexes  is 
dependent  on  kinetic  parameters  and  requires  higher  temperature  compared  to  low-
affinity MHC II/peptide complexes.  
 
 

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80 
Final discussion and outlook 
5
 
Final discussion and outlook 
As  antigen  presentation  by  MHC  II  molecules  plays  a  pivotal  role  in  the  adaptive 
immune response it is important to understand how antigenic peptides are selected and 
loaded  onto  MHC  II  molecules  which  is  catalyzed  by  DM.  The  crystal  structures  of 
MHC  II and DM are already known since 1993 and 1998, respectively,  (Brown et  al., 
1993;  Mosyak  et  al.,  1998)  and  mutagenesis  studies  mapped  a  large  lateral  surface  on 
both  molecules  required  for  interaction  which  has  been  confirmed  by  tethering 
experiments  (Busch  et  al.,  2002;  Stratikos  et  al.,  2002).  However,  the  molecular 
mechanism  of  how  DM  catalyzes  peptide  exchange  on  MHC  II  molecules  is  still 
unknown  and  different  models  have  been  proposed  including  DM  targeting  the 
hydrogen  bond  network  between  peptide  and  MHC II  (Mosyak  et  al.,  1998;  Weber  et 
al., 1996) as well as global conformational changes (Belmares et al., 2002).  
Recent  studies  in  the  lab  showed  strong  DM  binding  to  a  low  stability  DR/peptide 
complex  missing  three  N-terminal  peptide  residues  (Anders  et  al.,  2011)  and  thereby 
disrupting  conserved  MHC II-peptide  interactions.  The  question  arose  whether  the 
truncated  peptide  represented  an  intermediate  state  of  a  DR/peptide  complex  with  the 
peptide  N-terminus  partially  released  due  to  peptide  mobility.  However,  some  high-
affinity complexes, e.g. DR1/HA, were believed to be resistant to DM action as no DM-
facilitated  peptide  exchange  had  been  observed  (Kropshofer  et  al.,  1996;  Sloan  et  al., 
1995)  arguing  against  this  model  which  implied  DM  binding  to  any  MHC II/peptide 
complex,  even  if  to  a  small  extent.  Crucial  surface  plasmon  resonance  experiments 
undertaken  during  this  study  revealed  concentration-  and  temperature-dependent  DM 
binding  to  the  high-affinity  complexes  DR1/HA  and  DR2/MBP,  previously  exhibiting 
no  and  only  little  DM  binding,  respectively.  These  data  demonstrated  that  at  high 
temperature  DM  binding  can  be  detected  to  high-affinity  MHC II/peptide  complexes 
previously believed to be DM resistant substantiating the relevance of peptide mobility 
for DM catalyzed peptide exchange and supporting the model of spontaneous release of 
peptide N-terminus (Anders et al., 2011). Furthermore, the functional significance of the 
SPR data was demonstrated during these studies by comparing DM binding experiments 
with  DM  activity  data measured by  fluorescence  polarization  displaying  an agreement 
between both assays.  
NMR experiments performed during this work further addressed peptide mobility in 
the peptide-binding groove revealing the presence of multiple peptide conformations for 

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81 
Final discussion and outlook 
MBP  peptide  bound  to  DR2  molecule  and  advanced  the  image  of  MHC II/peptide 
complexes which is so far mainly influenced by the static picture of crystal structures. 
In  the  future,  a  distinct  peak  assignment  of  the  NMR  spectra  could  provide  more 
detailed information about peptide dynamics in the peptide-binding groove.  
Besides  peptide  mobility  which  probably  plays  an  important  role  in  the  peptide 
exchange mechanism of MHC II molecules, another important factor for understanding 
the interaction between DM and MHC II might be the presence of multiple conformers 
of both molecules (Busch et al., 1998; Chou and Sadegh-Nasseri, 2000; Zarutskie et al., 
1999). For example, empty MHC  II molecules are known to rapidly loose their ability 
to  bind  peptides  and  aggregate  (Germain  and  Rinker,  1993;  Rabinowitz  et  al.,  1998). 
Molecular dynamics simulations of empty MHC II molecules predict a partial collapse 
of  the  peptide-binding  groove  (Painter  et  al.,  2008;  Rupp  et  al.,  2011)  suggesting  that 
major  conformational  changes  may  occur  once  the  peptide  leaves  the  binding  groove. 
The MHC II receptive conformation which rapidly binds peptide is of special interest as 
it  may  reveal  important  features  of  the  peptide  exchange  mechanism  and  likely 
represents the conformation DM binds to but on the other hand is probably also short-
lived.  During  this  study  a  DR1  structure  is  presented  carrying  an  HA  peptide  variant 
missing two N-terminal peptide residues that reveals an intermediate state of a MHC II 
molecule during peptide release. As had been shown that the peptide N-terminus has to 
leave the  binding  groove in  order for DM to  bind  (Anders et  al.,  2011) it  is  crucial to 
know  what  conformation  MHC  II  molecules  adapt  once  the  peptide  N-terminus  is 
absent as that might be a conformation DM readily binds to and could give insight into 
the  peptide  exchange  mechanism.  Concerning  the  structure  surprisingly  no  major  but 
small conformational changes were observed including a small divergence of the α and 
ß helices  normally  adjacent  to the peptide N-terminus  and an altered conformer  of the 
conserved residue Valβ85 which partially opens up the P1 pocket. A narrowing of the 
binding  groove  was  not  observed  as  predicted  by  molecular  dynamics  simulations  for 
empty MHC II molecules  (Painter et  al.,  2008;  Rupp et  al.,  2011), but  might  require a 
larger part of the peptide to be absent. Overall the DR1 structure seems to be relatively 
stable even if three  conserved hydrogen bonds are disrupted  and small  conformational 
changes  appear  to  destabilize  the  P1  anchor  that  may  facilitate  further  release  of  the 
peptide. Although SPR data showed that the crystallized DR1/peptide complex binds to 
DM, it is not clear, yet, whether the crystallized structure represents the DR conformer 
DM  binds  to  as  DM  may  bind  to  a  more  dynamic  and  energetically  less  stable 

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