Tunel apoptosis Detection Kit



Yüklə 68,12 Kb.
Pdf görüntüsü
tarix16.06.2018
ölçüsü68,12 Kb.
#49148


 

 

 



TUNEL Two-Color Apoptosis Detection Kit                  Cat. No. L00429 

(TRITC-labeled, for Flow

 

Cytometry)           



                                           

Technical Manual No. TM0265                                                  Version 03102011 

 

 

 

 



Description ………………………………………………………………. …………………

  1 

II 

Key Features 

……………………………………………………………. . ………………

.. 



III 

Kit Contents 

………………………………………………………. . ………………………

  1 

IV 

Storage..

………………………………………………………………………………………

  2 



Protocol 

……………………………………………….……………………………………





VI 

Related Products

……………………………………………………………………………

 



VII 

Troubleshooting 

…….………………………………………………………………

...

……. 

 



VIII 

Ordering Information…

.

……………………………………………………………

..

……

..

 

   


 

 

I.    DESCRIPTION 



TUNEL Two-Color Apoptosis Detection Kit (TRITC-labeled, for 

Flow Cytometry

 ) (Cat. No. L00429) is used for 

the  fast  detection  of  fragmented  DNA  in  the  nucleus  during  apoptosis.  In  this  modified  TUNEL  assay  kit, 

fluorescein-labeled  nucleotides  binds  with  the  DNA  3´-OH  ends  using  natural  or  recombinant  terminal 

deoxynucleotidyl transferase (TdT or rTdT). The fluorescence could be detectd by Flow Cytometry. 

       

 

II. 



KEY FECTURES 



 



Simplified Procedure: The kit contains ready-to-use reagents. 



 



Enhanced Sensitivity: This kit can assay the cells during the early stages of apoptosis.   



 



Enhanced Specificity: The kit can stain apoptotic cells. 



 



Streamlined Process: The entire procedure takes about 3 hours. 



 



High Veracity: The kit contains positive control reagent. 

                                             



III.    KIT CONTENTS 

The TUNEL Apoptosis Detection Kit is available.    L00429 is for detection using fluorescein Labeled nucleotides 

(TRITC-5-dUTP).     

 

Components 

Cat. No.L00429   

20 Assays 

Cat. No.L00429   

50 Assays 

Cat. No. L00429   

100 Assays   

Storage Conditions 

Equilibration Buffer 

1 ml 

2.5 ml 


    5.0 ml   

-20°C


  

TRITC-5-dUTP 

20 µl 

50 µl 


  100 µl   

-20°C


 

TdT 


80 µl 

200 µl 


  400 µl   

-20°C


 

DAPI/RNase Buffer

 

10 ml 


25 ml 

50 ml 


-20°C 


 

 



 

DNase I (50 U/µl)   

0.2 ml 

0.5 ml 


1 ml 

-20°C 


1X

 

DNase I buffer 



0.2 ml 

0.5 ml 


1 ml 

4°C 


 

Note: Controls are not provided with kit 

 

IV.    STORAGE 

Store the kit at -20°C.    It will remain stable for one year. 

 

V.    PROTOCOL

 

Before use, order or prepare the following: 

 

Fixation Solution: 1% paraformaldehyde in PBS, pH 7.4, freshly prepared. 

Permeabilization Solution: 0.1% Triton X-100 and 0.1% sodium citrate in water, freshly prepared. 

 

Note:   

1. Please centrifuge the reagents in the kit before use. 

2. Please prepare the proper amount of TUNEL Reaction Mixture according to the amount of the samples to save 

reagent.   

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 



 

 

Cell Samples 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                   

 

 

                                                               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Rinse slides two times with PBS for five minutes each time. 

 

Incubate with Blocking solution for 10 min at 15-25°C.   



The Blocking solution contains 3% H

2

O

2



 in methanol.

 



 

Rinse slides two times with PBS for five minutes each. 

 

                                                                                                                                                                                     



Fix cell samples with iced Fixation Solution for 30-60 mins at 4°C. (adjust the 

concentration of cells to 1-2×10



6

cells/mL

(The Fixation solution contains 1% Paraformaldehyde in PBS, pH 7.4, freshly prepared.) 

 

Centrifuge and collect the cells at 300g for 5 min, rinse the cells with 5 mL of iced PBS for 



twice 

Discard the suspension (PBS), and resuspend the cell with residual PBS 

Fix cell sample with 70% iced ethanol for more than 30 minutes or until before use at 

-20°C. (adjust the concentration of cells to 1-2

×

10

6

cells/mL

)

 

 



 

Centrifuge and collect the cells at 300 g for 5 min, then rinse the cells with 1 mL of iced 

PBS for twice. 

 

Incubate in 1 mL Permeabilization Solution on ice (2-8°C) for two minutes. 



(The Permeabilization Solution contains 0.1% Triton X-100 and 0.1% sodium citrate in 

water, freshly prepared.) 

 

Proceed as described in the Labeling Protocol. 



 

Collect the cells 

Centrifuge and collect the cells with 300g for 5 min, then rinse the cells with 1 mL iced PBS 

for twice. 

 



 

 



 

Controls: 

Negative control: Employ the cells or sections as described the labeling protocol.    Label solution but do not add   

any Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) in TUNEL Reaction Mixture. 



Positive control: Before beginning the labeling procedure, incubate the fixed and permeabilized cells or sections   

with 100 

μl

 DNase I Solution for 10 -30 minutes at 21-37°C to induce DNA strand degradation.   

DNase I Solution contains

 

10000 U/ml-20000 U/ml DNase I (grade I) depending on the sample to be stained in 1



×

DNase I buffer. One example of 1

×

  DNase I buffer is 10 mM CaCl



2

, 6 mM MgCl

2

, and 10 mM NaCl in 40 mM 



Tris-HCl, pH 7.9.   

 

Labeling Protocol   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

The pretreated cells 



Add 50 µl TUNEL Reaction Mixture to samples.    Add a coverslip and incubate for 60 

minutes at 37°C under wet conditions, protected from light. 

(The TUNEL Reaction Mixture contains 45 µl Equilibration Buffer, 1 µl TRITC-5-dUTP 

and 4 µl TdT, freshly prepared.) 



Note: Add 50 

μl

 Label Solution to the negative control.    To ensure a homogeneous dispersal of 



TUNEL Reaction Mixture across the cell monolayer and to avoid loss to evaporation, the samples 

should be covered with parafilm or a coverslip during incubation. 

 

Rinse slides with PBS two times for five minutes each time. 



Suspend the cells with 300-500ul DAPI/RNase Buffer at 15-25

 for 30 min, protected from light. 



Analyse with Flow Cytometry: TRITC ( red fluorescence ) using excitation wave 543 nm and 

emission wave 571 nm; DAPI ( blue fluorescence ) using ultraviolet excitation wave 340/380nm.

 



 

 



 

VI. RELATED PRODUCTS   

TUNEL Universal Apoptosis Detection Kit (Biotin labeled POD ), Cat. No. L00290 

TUNEL Apoptosis Detection Kit for Adherent Cells (Biotin labeled POD ), Cat. No. L00296 

TUNEL Apoptosis Detection Kit for Paraffin-embedded Tissue Sections (Biotin labeled POD), Cat. No. L00297 

TUNEL Apoptosis Detection Kit for Adherent Cells (FITC labeled POD ), Cat. No. L00299 

TUNEL Apoptosis Detection Kit for Paraffin-embedded Tissue Sections (FITC labeled POD), Cat. No. L00300 

TUNEL Universal Apoptosis Detection Kit (For cell tissue section, TRITC-labeled), Cat. No. L00426 

TUNEL Two-Color Apoptosis Detection Kit (FITC-labeled, for flow cytometry),    Cat. No. L00428 

TUNEL Universal Apoptosis Detection Kit (For cell tissue section, FITC-labeled), Cat. No. L00427 

 

VII. TROUBLESHOOTING 



TdT Dilution Buffer* contains 150 mM KCl, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 50 % glycerol in 60 mM KPB, pH 7.2. 

 

Problem 

Step/Reagent 

Possible cause 

Solution 

 

 



 

 

 



High 

background 

Fixation 

Formalin fixation leads 

to a yellowish stain in 

cells containing melanin 

precursors. 

Use  methanol  for  fixation.    However,  this 

may lead to reduced sensitivity. 

TUNEL reaction 

 

The concentration of the 



labeling mix is too high. 

 

Reduce concentration of labeling mix from 



10% to 50%. 

 

Converter solution 



There is endogenous 

peroxidase activity. 

Prior to cell permeabilization, block 

endogenous peroxidase by incubating for 10 

minutes in methanol containing 3% H

2

O



2

 at 


15-25°C. 

Streptavidin-HRP has 

engaged in non-specific 

binding. 

Block with anti

-mouse serum. 

• Block with PBS containing 3% BSA for 20 

minutes. 

• Reduce the concentration of 

 

Streptavidin-HRP Solution to 50%.   



The DAB incubation 

time is too long.   

Reduce the time of incubation.   

 

Sample 



Mycoplasma 

contamination   

Use a mycoplasma detection kit.   

Highly proliferating   

cells   

Double staining with Annexin-V-Fluos* or a 

similar substance. 

Note: High background may make 

measuring with microplate readers 

impractical. 



 

 



 

Non-specific 

staining 

Fixation 

After fixation, nuclease 

activity is still high.             

Block with the buffer containing dUTP and 

dATP 


TUNEL reaction 

The concentration of 

TdT is too high. 

Reduce concentration of TdT from 10% to 

50% with TdT dilution buffer*. 

 

Low rate of 



labeling 

 

Fixation 



Ethanol  and  methanol 

can  lead  to  diminished 

labeling  (chromatins  are 

not 


cross-linked 

with 


proteins  during  fixation; 

they  are  lost  during  the 

procedure steps). 

Fixate using 4% paraformaldehyde buffer

formalin, or glutaraldehyde. 

Extensive fixation leads 

to excessive 

cross-linkage with   

proteins. 

Reduce  fixation  time  or  fix  by  using  2% 

paraformaldehyde PBS buffer (pH 7.4). 

Permeabilization 

The permeabilization 

step is too short and the 

reagents can’t reach 

their target molecules. 

• Increase the incubation time. 

 

• Incubate at a higher temperature (such as 



15-25°C).   

• Optimize the concentration and action time 

of proteinase K. 

• Incubate with 0.1

 M sodium citrate at 70°C 

for 30 minutes. 

No signal on 

positive 

control 

DNase treatment 

The concentration of 

DNase I Buffer is too 

low. 

• 

Incubate with 30000U/ml DNase I Solution* 



or higher for 30 min at 37°C, and then rinse 

with PBS.   

 

Weak signals 



Counterstaining 

The dye is not suitable. 

Counterstain with 5% methyl green in 0.1 M 

veronal acetate, pH 4.0 or Hematoxilin.   

 

 

VIII. ORDERING INFORMATION 

TUNEL Two-Color Apoptosis Detection Kit (TRITC-labeled, for flow cytometry), Cat. No. L00429 

 

GenScript 



USA Inc

 

860 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854 



Tel: 1-877-436-7274 

Fax: 1-732-210-0262 

E-mail: 

product@genscript.com



 

Web: www.genscript.com 



For Research Use Only. 

Yüklə 68,12 Kb.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə