Vulgare L. Yarpaqlarında Antioksidant Fermentlərin Fəallığının və İzoenzim
Yüklə 147,67 Kb. Pdf görüntüsü
|
| АМЕА-nın Xəbərləri (biologiya və tibb elmləri), cild 69, №2, səh. 5-13 (2014)
5 Quraqlıq Stresinin Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin (Hordeum vulgare L.) Yarpaqlarında Antioksidant Fermentlərin Fəallığının və İzoenzim Tərkibinin Tədqiqi İ.M. Hüseynova 1* , M.Y. Nəsrullayeva 2 , S.M. Rüstəmova 1 , D.R. Əliyeva 1 , C.Ə. Əliyev 1 1
2 AMEA Genetik Ehtiyatlar İnstitutu, Azadlıq prospekti, 155, Bakı AZ 1106, Azərbaycan; *E-mail: huseynova-i@botany-az.org Quraqlıq bütün dünyada bitkilərin məhsuldarlığını və dənin keyfiyyətini aşağı salan əsas stres amillərindən biridir. Arpa bitkisi zəngin genetik müxtəlifliyə malik olub ətraf mühitin əlverişsiz amillərinə qarşı kontrast genotiplərin cavab reaksiyalarını qiymətləndirmək üçün mühüm mənbədir. Antioksidant metabolizm bitkilərin quraqlığa cavab reaksiyalarında əhəmiyyətli rol oynaya bilir. Tədqim olunan işin məqsədi quraqlıq stresi zamanı antioksidant fermentlər səviyyəsində aşkar olunan fərqlər əsasında arpa genotiplərinin quraqlığa davamlılıq variasiyalarının müəyyən edilməsi olmuşdur. Torpaq quraqlığına məruz qalmış 4 arpa genotipinin yarpaqlarında katalaza (KAT), askorbatperoksidaza (APO), qlütation-reduktaza (QR) və superoksiddismutaza (SOD) fermentlərinin fəallıqları və izoenzim tərkibləri öyrənilmişdir. Quraqlığa məruz qalmış bitkilərdə KAT və SOD-un fəallıqları artmış, APO-nun fəallığı isə azalmışdır. Kəskin quraqlıq şəraitində QR-in ümumi fəallığı К 2778 və St. Qarabağ 7 genotiplərində artmış, yerli №77 və St.Pallidum 596 genotiplərində isə azalmışdır. Normal suvarma şəraitində becərilən nümunələrlə müqayisədə stres zamanı fermentlərin izoenzim tərkibində əsaslı fərqlər (yeni izoformaların əmələ gəlməsi və yaxud itməsi) müşahidə edilməmiş, lakin elektroforetik spektrlərdə uyğun izoformaların intensivliyi artmışdır.
izoenzim tərkibi
GİRİŞ Digər dənli bitkilərlə müqayisədə, arpa dən və samanının keyfiyyəti baxımından yem bitkisi kimi daha dəyərlidir. Bütün dünyada kənd təsərrüfatı bitkilərinin məhsuldarlığını və dənin keyfiyyətini aşağı salan əsas stres amillərindən biri quraqlıqdır (Aranjuelo et al., 2011; Li et al., 2013). İqlim dəyişikilikləri üzrə fəaliyyət göstərən müxtəlif Dövlətlərarası Qrupların ekspertləri tərəfindən irəli sürülən proqnozlara əsasən, gələcəkdə yağıntıların daha da azalması və nəticədə evapotranspirasiya proseslərinin güclənməsi gözlənilir (Solomon et al., 2007). Məlumdur ki, bitki orqanizmində su qıtlığı kimi stres amilin təsirindən baş verən oksidləşdirici proseslər nəticəsində oksigenin fəal formaları (OFF) olan superoksid (O 2 •
2 O 2 ), hidroksil radikalları (ОН • ) və atomar oksigenin ( 1 О 2 ) miqdarı sürətlə artır (Faize et al., 2011). Hüceyrədə OFF ilə antioksidant fermentlər arasında mövcud balansın pozulması bir sıra oksidləşdirici zədələnmələrin əmələ gəlməsinə zəmin yaradır. OFF olduqca yüksək aktivliyə malikdir və onların artıq miqdarı membran lipidləri, zülallar və nuklein turşularına əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərərək ciddi zədələnmələrə gətirib çıxarır (Apel and Hirt, 2004). Bitkilər OFF-larıının zədələyici təsirini aradan qaldıra biləcək güclü antioksidant sistemə malikdirlər (Joseph and Jini, 2011). Bitki orqanizmində yaranan OFF-ların toksiki təsirinə qarşı
fəaliyyət göstərən fermentativ (superoksiddismutaza, katalaza, askorbat-peroksida- za, qlütationreduktaza və s.) və qeyri-fermentativ (askorbin turşusu, tokoferol, qlutation, fenol birləş- mələri və s.) antioksidant sistemlər mövcuddur. Bir qayda olaraq, hər hüceyrə kompartmenti konkret OFF-ni zərərsizləşdirə bilən bir və ya bir neçə fermentativ fəallığa malikdir. Antioksidant ferment- lər praktiki olaraq hüceyrənin bütün kompartmentlə- rində OFF-ini detoksikasiya edərək, bitkinin müdafiə sistemində əhəmiyyətli rol oynayır (Mittler, 2002; Ahmad et al., 2010). Son on il ərzində bitki orqanizminin oksidləş- dirici stresə qarşı cavab reaksiyalarının molekulyar- genetik mexanizmləri daha dərin şəkildə öyrənil- mişdir. Müəyyən edilmişdir ki, bitkilərdə 150-dən artıq gen OFF-in detoksikasiyasında iştirak edən fermentlərin sintezini kodlaşdıraraq yüksək təşkil olunmuş OFF gen şəbəkəsini əmələ gətirir (Mittler et al., 2004). Bitkilərin antioksidant müdafiə sis- temlərini kodlaşdıran bəzi genlər artıq klonlaşdırıla- raq, transgen xətlərin alınmasında istifadə olunur (Sarovar et al., 2005). Ətraf mühitin əlverişsiz stres amillərinə qarşı yüksək davamlılığın əldə olunma- Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin 6 sında hüceyrədə əsas funksiyalara cavabdeh olan, yəni hüceyrə komponentlərinin quruluşunu saxlaya bilən genlərlə aparılan manipulyasiyalar böyük əhəmiyyət kəsb edir. Bu istiqamətdə müasir ədəbiyyat məlumatlarının təhlili göstərmişdir ki, stres amillərinə qarşı ümumi cavab reaksiyası mövcud deyildir (Fayez and Bazaid, 2014; Amini, 2013; Faize et al., 2011; Ashraf, 2010). Antioksidant sistemin eyni bir stres amilinə qarşı cavab reaksiyası bitkinin növündən, onun yaşı və be- cərilmə şəraitindən asılıdır (Polesskaya, 2007). Eyni zamanda antioksidant sistemin cavab reaksiyası stre- sin müddəti ilə də müəyyən edilir (Aranjuelo et al., 2011; Ashraf, 2010; Fu and Huang, 2001). Antioksidant sistemin oksidləşdirici stresə qarşı cavab reaksiyası bitkinin fizioloji vəziyyəti ilə determinə olunan fermentlərin fəallığından da asılıdır (Shao et al., 2005). Yuxarıda qeyd olunanları nəzərə alaraq, təqdim olunan işin əsas məqsədi torpaqda su qıtlığı şəraitin- də yetişdirilən müxtəlif arpa genotiplərində antioksi- dant fermentlərdən katalaza, askorbat peroksidaza, qlütation reduktaza və superoksiddismutazanın fəal- lıqlarının və izoferment tərkibinin tədqiqi olmuşdur.
MATERİAL VƏ METODLAR
Tədqiqat obyekti kimi, Nutans növ müxtəlifli- yinə aid St.Qarabağ-7 və № 77 yerli, Pallidum növ müxtəlifliyinə aid Pallidum-596 və K-2778 genotipləri götürülmüşdür. Bitkilər Azərbaycan Elmi-Tədqiqat Əkinçilik İnstitutunun Cəlilabad Bölgə Təcrübə Stansiyasında normal suvarma və su qıtlığı şəraitində becərilmişdir. Katalaza fermentinin fəallığının təyini
Katalazanın (KAT) fəallığının təyini üçün 1 q yarpaq toxuması 10 ml 50 mM kalium-fosfat buferində (pH 7.0) əzilmişdir. Homogenat filtrasiya edilmiş və 10 dəqiqə ərzində 8000 g-də sentrifuqalaşdırılmışdır. 2,9 ml fosfat buferinin (pH 7,0) üzərinə 25 mkl alınmış ferment ekstraktı tökülmüşdür. Ölçmədən qabaq bu məhlula 90 mkl 3 %-li H 2
2 əlavə edilmişdir. Spektrofotometrdə 1 dəqiqə ərzində 240 nm dalğa uzunluğunda optik sıxlığın düşməsi ölçülmüşdür. Fermentin fəallığı molyar ekstinksiya əmsalı ε=39,4 mM -1 sm -1
əsasında mmol/(q·dəq) vahidində hesablanmışdır (Kumar and Knowles, 1993). Askorbatperoksidaza fermentinin fəallığının təyini Askorbatperoksidazanın (APO) fəallığını təyin etmək üçün 1 q yarpaq götürülmüş və soyuqda 10 ml 50 mM kalium-fosfat buferində (pH 7,6) əzilmişdir. 0,3 q PVP əlavə edildikdən sonra süzülmüş və 10 də- qiqə ərzində 12000 g-də sentrifuqalaşdırılmışdır. Re- aksiya qarışığının tərkibində 50 mkM 0,1 mM H 2 O 2 , 2,55 ml 50 mM fosfat buferi (pH 7,6) və homogenatı sentrifuqalaşdırdıqdan sonra alınan bitki ekstraktından 300 mkl götürülmüşdür. Optik sıxlıq ULTROSPEC 3300 PRO (“AMERSHAM”, ABŞ) spektrofotome- trində, nəzarət kimi fermentsiz ekstrakt götürülərək 290 nm dalğa uzunluğunda ölçülmüşdür. APO-nun fəallıq ölçüsü kimi reaksiyanın ilk 30 saniyəsində op- tik sıxlığın düşməsi götürülmüş və molyar ekstinksiya əmsalı kimi ε=2,8 mM -1 sm
nəzərə alınaraq, mmol/q·dəq vahidində hesablanmışdır (Nakano and Asada, 1981).
Qlütation reduktaza fermentinin fəallığının təyini
Qlütation reduktazanın (QR) fəallığı spektrofotometrik üsulla 340 nm dalğa uzunluğunda oksidləşmiş qlütationun iştirakı ilə NADFH-ın oksidləşməsi əsasında müəyyən edilmişdir (Yannarelli, 2007). Reaksiya mühitində 100 mM fosfat buferi (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,2 mM NADF H və 0,5 mM oksidləşmiş qlütation olur. Optik sıxlıq 10 dəqiqə müddətində ölçülmüşdür. Fermentin aktivliyi mkmol/(mq dəq) ilə ölçülür, əsas molyar ekstinksiya əmsalı ε=6,2 mM -1
-1 götürülmüşdür (Yannarelli, 2007).
Superoksiddismutazanın (SOD) fəallığını təyin etmək üçün spesifik kitdən (SOD Assay Kit-WST, Sigma-Aldrich) istifadə olunmuşdur. Bitki hüceyrə- lərində SOD-un bir neçə izoforması mövcuddur. Fer- mentin sitozol forması tədqiq edilmişdir. Çəkilmiş yarpaqlar 50 mM kalium-fosfat buferində (pH 7,8) homogenləşdirilmişdir. Homogenat sentrifuqalaşdırıl- mış, supernatantdan SOD-un sitozol formasını özün- də saxlayan qarışıq kimi istifadə olunmuşdur. Optik sıxlıq 450 nm dalğa uzunluğunda təyin edilmişdir .
Zülalların miqdarı Sedmak metoduna əsaslanaraq, Kumasi-G250 rəngləyicisindən və qliserindən istifadə etməklə (1:1) təyin edilmişdir (Sedmak and Grossberg, 1977). Fermentlərinin keyfiyyət tərkibinin elektroforetik təyini
Askorbatperoksidaza və katalazanın aktivlik- lərinin keyfiyyət dəyişkənliyi Lemmli metoduna əsasən (Laemmli, 1970) nativ poliakrilamid gel Hüseynova və b. 7 (PAAG) elektroforez üsulu ilə öyrənilmişdir. Zülalların miqdarı Sedmak metoduna əsasən (Sedmak and Grossberg, 1977) müəyyən olunmuş, standart zülal kimi öküzün zərdab albuminindən istifadə edilmişdir. Elektroforez 0,75 mm qalınlığa, 8 sm hündürlüyə malik 7%-li (KAT üçün) və 10%- li (APO üçün) PAAG-də Tris-HCl buferində (pH 8,3) 3 saat 4°C temperaturda 30 mA sabit cərəyanda SE 250 (“Amersham Biosciences”, ABŞ) cihazında aparılmışdır. Askorbatperoksidazanın izoenzim tərkibi Mit- tler və Zilinskas metoduna əsasən (Mittler and Zilinskas, 1993) təyin edilmiş, elektrod buferinə 2 mM natrium askorbat əlavə edilmişdir. Elektrofo- rezdən sonra gel tərkibində 2 mM Na-askorbat olan 50 mM kalium fosfat buferində (pH 7,0) 30 dəqiqə inkubasiya olunur. Bundan sonra gel 20 dəqiqə tər- kibində 4 mM Na-askorbat və 2 mM H 2 O 2 olan 50 mM kalium fosfat buferində (pH 7,0) saxlanılmış, daha sonra tərkibində 28 mM TEMED və 2,45 mM nitro tetrazolium mavisi olan 50 mM kalium fosfat buferində (pH 7,8) ag fonda mavi xəttlər görünənə qədər inkubasiya olunmuşdur. Katalazanın izoenzim tərkibini təyin etmək üçün gel 1% K 3 [Fe(CN) 6 ], 1% FeCl 3 və 3,27 mM H 2 O 2 məhlulunda 20 dəqiqə qaranlıqda saxlandıqdan sonra işığa keçirilir və tünd göy fonda sarı xəttlər görünənə qədər inkubasiya olunmuşdur (Woodbury et al., 1971).
Normal suvarma və quraqlıq şəraitlərində becə- rilən arpa genotiplərinin antioksidant sisteminin fəal- lığında əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilmişdir. Bit- kilərin oksidləşdirici stresə qarşı müdafiə sistemində əsas rol oynayan antioksidant fermentlərdən biri katalazadır. Bu ferment hidrogen peroksidin sürətli utilizasiyasını təmin edir (Mhamdi et al., 2010). Buna görə də normal suvarma və quraqlıq stresi zamanı Nutans növ müxtəlifliyinə aid St.Qarabağ-7 və № 77 Yerli və Pallidum növ müxtəlifliyinə aid St.Pallidum 596 və K-2778 genotiplərində katalaza fermentinin fəallığı təyin edilmişdir (Şəkil 1). Normal suvarılan bitkilərdə katalazanın fəallığında əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilməmişdir. St.Qarabağ-7 genotipində digər genotiplərlə müqayisədə katalazanın fəallığı bir qədər yüksək (140±12 mkMol/mq.dəq), Pallidum-596 genotipində isə nisbətən aşağı olmuşdur (90±10 mkMol/mq·dəq). № 77 Yerli və K-2778 genotiplərində normal suvarma zamanı katalazanın fəallığı demək olar ki, eyni qiymətə malik olmuşdur. Quraqlıq stresinin təsirinə məruz qalmış bütün genotiplərdə KAT-ın fəallığı yüksək olmuşdur. St.Qarabağ-7 genotipində normal suvarılan bitkilərlə müqayisədə su qıtlığı zamanı katalazanın fəallığı 2 dəfəyədək artmış və 260±24 mkMol/mq.dəq təşkil etmişdir. № 77 Yerli və K-2778 genotiplərində normal suvarma zamanı olduğu kimi, quraqlığın təsirindən katalazanın fəallığı, demək olar ki, eyni səviyyədə yüksəlmişdir. Pallidum-596 genotipində su qıtlığı zamanı KAT-ın fəallığı nisbətən az artmış və 100±12 mkMol/mq·dəq təşkil etmişdir. Quraqlıq zamanı katalazanın yüksək fəallığı onun stresə qarşı müdafiə funksiyası rolunu göstərir. Katalaza fermenti xromoproteidlərə aid olub, prostetik qrup (qeyri-zülal) kimi oksidləşmiş hem saxlayır. Mübadilə reaksiyaları zamanı əmələ gələn hidrogen- peroksid müəyyən qatılıqlarda hüceyrə üçün toksiki təsir göstərir. Katalaza fermenti hidrogen-peroksidi zərərsizləşdirərək, onu suya və qeyri-aktiv molekulyar oksigenə çevirir (Mittler, 2002). 0 50
150 200
250 300
St.Qarabağ 7 № 77 Yerli St.Pallidum 596 K-2778 KAT -ı n f əal lı ğı ( m kM ol/m q d əq) Kontrol Stres
Şəkil 1. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində katalaza fermentinin fəallığı. Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin 8 0 100 200
300 400
500 600
700 800
St.Qarabağ 7 № 77 Yerli St.Pallidum 596 K-2778 AP O -nun f əall ığ ı ( m kM ol/m q də q) Kontrol Stres
Şəkil 2. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində askorbatperoksidaza fermentinin fəallığı.
Canlı hüceyrələrdə katalaza fermenti ilə yana- şı, hidrogen-peroksidi zərərsizləşdirən peroksidaza fermenti də vardır. Lakin sübut olunmuşdur ki, ka- talaza öz katalitik funksiyasını peroksidazadan asılı olmayaraq yerinə yetirir. Peroksidlərin aşağı səviy- yələrində öz funksiyasını yerinə yetirən peroksida- zalardan fərqli olaraq, katalaza peroksidlərin yüksək qatılıqlarında da effektiv təsir göstərir. Bitkilərin oksidləşdirici stresdən müdafiəsində askorbatperoksidaza fermenti də mühüm rol oynayır (Najami et al., 2008; Sarvajeet and Narendra, 2010). APO bitki hüceyrələrində xloroplastda və sitozolda hidrogen peroksidin utilizasiyasında açar ferment rolunu oynayır. Arpa genotiplərində askorbat- peroksidaza fermentinin də fəallığı normal suvarma və quraqlıq şəraitində analiz edilmişdir (Şəkil 2). Normal suvarılma zamanı St.Qarabağ-7 genotipi katalaza fermentinin maksimal fəallığı ilə xarakterizə olunduğu halda, askorbatperoksidaza fermenti isə əksinə, digər genotiplərlə müqayisədə minimal fəallıq göstərir (280±22 mkMol/ mq·dəq). Ayrı-ayrı növmüxtəlifliklərinə aid olmalarına baxmayaraq, arpanın № 77 Yerli və K-2778 genotiplərində askorbatperoksidaza fermentinin fəallığı, demək olar ki, eynidir və uyğun olaraq № 77 Yerli üçün - 640±52 mkMol/mq·dəq, K-2778 genotipi üçün isə - 640±66 mkMol/mq·dəq təşkil edir. Maraqlıdır ki, katalaza fermentinin də fəallığı bu genotiplərdə eyni qiymətə malikdir. Arpanın St.Pallidum 596 genotipində normal suvarma zamanı askorbatperoksidaza fermentinin maksimal fəallığı müşahidə edildiyi halda (660±56 mkMol/mq·dəq), KAT bu genotipdə minimal fəallıq götərmişdir. Quraqlığın arpa genotiplərində askorbatperoksi- daza fermentinin fəallığına təsiri şəkil 2-də göstəril- mişdir. Şəkildən göründüyü kimi, katalaza fermentin- dən fərqli olaraq, bütün genotiplərdə su qıtlığının təsirindən askorbatperoksidazanın fəallığı aşağı düş- müşdür. Bu zaman fermentin minimal fəallığı №St. Qarabağ-7 genotipində (240±21 mkMol/ mq·dəq), maksimal fəallıq isə K-2778 genotipində (360±33 mkMol/mq·dəq) müşahidə edilmişdir. Su qıtlığı şəra- itində askorbat-peroksidaza fermentinin maksimal fə- allığı ilə xarakterizə olunan K-2778 genotipində kon- trola nəzərən fermentin fəallığı, təxminən 2 dəfəyə qədər aşağı düşür. Stres zamanı arpanın № 77 Yerli və St.Pallidum-596 genotiplərində askorbatperoksi- daza fermentinin fəallığı eyni olmuşdur. APO askorbatın oksidləşməsini kataliz edir və monodehidroaskorbat (MDA) radikalının meydana gəlməsinə gətirib çıxarır. APO-nun hüceyrə daxilində kompartmentləşməsinə görə 4 müxtəlif forması ayırd edilir: xloroplastlarda stromada həll olmuş forma (sAPX), xloroplastlarda tilakoidlə birləşmiş forma (tAPX), sitozol forma (cAPX) və qlioksisomal membran forma (gmAPX). Quraqlıq və istilik stresi zamanı APO-nun fəallığnın dəyişməsi müxtəlif müəlliflər tərəfindən qeyd olunmuşdur (Badiani et al., 1990). Eyni zamanda hidrogen peroksidin APO-nun sitozol fraksiyasının genini induksiyalaşdıraraq oksidləşdirici stresin təsiri zamanı siqnalların ötürülməsində iştirakı da məlumdur (Yoshimura et al., 2000). Qlütationreduktaza bitkilərin antioksidant sis- teminin müdafiəsində vacib ferment hesab edilir. O, qlutation-askorbat tsiklində NADFH + -ın iştirakı ilə oksidləşmiş qlutationun bərpasını kataliz edir (Saruhan et al., 2009). Tədqiqat zamanı qlütation- reduktaza fermentinin fəallığı da ölçülmüşdür (Şəkil 3). Normal suvarılan bitkilər arasında № 77 Hüseynova və b. 9 genotipi QR-nın maksimal fəllığı (99±10 mkMol/ mq·dəq), K-2778 genotipi isə bu fermentin mini- mal fəallığı (42±6 mkMol/mq·dəq) ilə xarakterizə olunur. Normal suvarma şəraitində qlutation-reduk- tazanın fəallığına görə aralıq yerləri St.Qarabağ-7 və St.Pallidum 596 genotipləri tutur. Tədqiq edilən arpa genotiplərinin bir hissə- sində su qıtlığının təsirindən qlütationreduktazanın fəallığı artmış, digərlərində isə, əksinə, azalmışdır (Şəkil 3). Su qıtlığı zamanı QR-in fəallığı üçün maksimal göstərici St.Qarabağ-7 genotipində (156±13 mkMol/mq·dəq), minimal göstərici isə St.Pallidum 596 genotipində (15±2 mkMol/ mq·dəq) müşahidə edilmişdir. Quraqlıq şəraitində QR-in fəallığına görə ikinci yerdə K-2778, növbəti yerdə isə № 77 Yerli genotipi dayanır. Maraq do- ğuran məqamlardan biri də odur ki, bu genotiplərdə KAT üçün də eyni tendensiya müşahidə edilmişdir. Amma stres və kontrol variantlarını öz aralarında müqayisə etdikdə, bir qədər fərqli mənzərənin şahidi oluruq. Belə ki, quraqlığın təsirindən QR-in fəallığında normal suvarılan variantla müqayisədə ən yüksək artım (3 dəfədən artıq) K-2778 genotipində müşahidə edilmişdir. St.Qarabağ-7 genotipində fermentin fəallığı, təxminən 2 dəfə yüksəlmişdir. Digər iki genotipdə, quraqlığın təsirindən qlütation-reduktazanın fəallığında azalma müşahidə edilmişdir. Kontrol variantla müqayisədə arpanın № 77 Yerli genotində QR-in fəallığı stressin təsirindən az, St.Pallidum 596 genotipində isə əhəmiyyətli dərəcədə (4 dəfə) aşağı düşmüşdür. QR bitkilərdə 4 izoformaya malikdir və müxtəlif hüceyrə kompartmentləri ilə assosiasiya təşkil edir. Bu fermentin daha çox miqdarı xloroplastlarla assosiasiyada olur, lakin sitozol və mitoxondrilərdə də izozimlər aşkar edilmişdir (Romero-Puertas et al., 2006; Saruhan et al., 2009). Superoksid radikalının reduksiyası zamanı əmələ gələn hidrogen-peroksid sitoplazma, xloroplast və membranda askorbat-peroksidazanın iştirakı ilə ayrılır. Bu zaman askorbatın oksidləşməsi baş verir: 2H 2
2 + askorbat → dehidroaskorbat + H 2 O
+ O 2 . Dehidroaskorbat reduksiya olunmuş qlutationun (QSH) iştirakı ilə askorbat-reduktazanı əmələ gətirir: 2QSH + dehidroaskorbat → QSSQ + askorbat. Oksidləşmiş qlutation (QSSQ) öz növbəsində NADFH(H +
qlutationa regenerasiya olunur: QSSQ + NADFH + H +
→ 2QSH + NADFH + . Superoksiddismutaza molekulyar oksigenin və hidrogen-peroksidin əmələ gəlməsi ilə gedən superoksid radikalının O 2 .-
kataliz edir. SOD bitkilərin oksidləşdirici stresə qarşı müdafiə sistemində ən vacib fermentlərdən biridir və bitkilərin bütün hüceyrələrində rast gəlinir (Alscher et al., 2002; Joseph and Jini, 2011). Müxtəlif arpa genotiplərində superoksiddismu- tazanın fəallığına su qıtlığının təsiri də tədqiq olunmuşdur (Şəkil 4). Normal suvarılma zamanı № 77 Yerli və K-2778 genotiplərində superoksid- dismutaza fermenti maksimal fəallıq göstərmişlər. Bu şəraitdə fermentinin fəllığının minimal qiyməti St.Pallidum 596 genotipində müşahidə edilmişdir (82±9 fəallıq vahidi/mq zülal).
20 40 60 80 100
120 140
160 180
St.Qarabağ 7 № 77 Yerli St.Pallidum 596 K-2778 GR -n ın f əal lı ğı (m k M ol /m q də q) Kontrol Stres
Şəkil 3. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində qlütation-reduktaza fermentinin fəallığı.
Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin 10
0 20 40 60 80 100 120 St.Qarabağ 7 № 77 Yerli St.Pallidum 596 K-2778 SO D -u n f əal lı ğı (f əal lı q v ah idi /m q zü la l) Kontrol Stres
Şəkil 4. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində superoksiddismutaza fermentinin fəallığı.
Şəkil 4-dən göründüyü kimi, tədqiq edilən arpa genotiplərində su qıtlığının təsirindən superoksid- dismutazanın fəallığı artmışdır. Stres şəraitində su- peroksiddismutaza fermentinin fəallığı üçün maksi- mal göstərici St.Qarabağ-7 genotipində (100±13 fəallıq vahidi/mq zülal), minimal göstərici isə St.Pallidum 596 genotipində (93±8 fəallıq vahi- di/mq zülal) müşahidə edilmişdir. Qeyd etmək ma- raqlı olar ki, stres zamanı qlütation-reduktaza fer- menti üçün də eyni tendensiya müşahidə edilmişdir. Quraqlıq şəraitində superoksiddismutaza fermenti- nin fəallığına görə ikinci yeri № 77 Yerli genotipi tutur. Növbəti yer arpanın K-2778 genotipinə aid- dir. Stres və kontrol variantlarını öz aralarında mü- qayisə etdikdə, bir az fərqli mənzərə müşahidə olunur. Belə ki, stresin təsirindən, superoksiddis- mutazanın fəallığında ən yüksək artım St.Qarabağ- 7 genotipində müşahidə edilir. Bu genotipdə fer- mentin fəallığı, normal suvarılan variantla müqayi- sədə təxminən ~1,2 dəfə yüksəlmişdir. Bir çox müəlliflər tərəfindən müxtəlif stres- sorların təsiri zamanı SOD-un antioksidant müdafiə sistemində əsas rol oynadığı göstərilir (Raychaudhuri, 2000; Alscher et al., 2002). Bununla yanaşı, SOD-un su qıtlığına qarşı müxtəlif reaksiya göstərən müxtəlif izoformaları var. Viqna bitkisində MnSOD və FeSOD-un aktivliyi su qıtlığına cavab olaraq sürətlə artır, bu zaman Cu/ZnSOD-un aktivliyi dəyişməz qalır (Brou et al., 2007). Məlumdur ki, SOD fermenti multimer metalloproteindir və bu fermentin aktiv mərkəzində yerləşən metalın tipindən asılı olaraq müxtəlif izoformaları vardır. Ədəbiyyat mənbələrinə görə SOD-un ən geniş yayılmış izoforması aktiv mərkəzində mis-sink (Cu/Zn-SOD), manqan (Mn- SOD), dəmir (Fe-SOD) və nikel (Ni-SOD) saxlayan formalardır (Faize et al., 2011). Bitki hüceyrələrində müxtəlif stres amillərinə qarşı SOD-un induksiya olunması onun bitkinin müdafiə sistemində əsas rol oynadığını göstərir. Ümumiyyətlə, su qıtlığı zamanı superoksid radikallarını utilizə etmək üçün SOD-un fəallığı artır. Məlumdur ki, duzluluq şəratinində və digər əlverişsiz mühit amillərinin təsiri zamanı bitkidə yaranan oksidləşdirici stresə qarşı müxtəlif mexa- nizimlər fəaliyyət göstərir. Oksigenin oksidləşməsi SOD üçün substrat əmələ gətirməkdən əlavə, müxtəlif mexanizmlərin işə düşməsinə səbəb olur. Beləliklə, normal suvarma və su qıtlığı şərait- lərində dörd müxtəlif arpa genotipində antioksidant müdafiə sisteminin əsas fermentlərinin tədqiqi nəticəsində aydın olmuşdur ki, quraqlıq stresinin təsirindən katalaza və superoksiddismutaza fer- mentlərinin fəallıqları tədqiq edilən arpa genotip- lərində yüksəlmiş, askorbatperoksidaza fermentinin fəallığı isə, əksinə, su qıtlığı zamanı azalmışdır. Qlütationreduktaza fermentinin fəallığı quraqlıq stresinə cavab olaraq, St.Qarabağ-7 və K-2778 ge- notiplərində yüksəlmiş, № 77 Yerli və St.Pallidum 596 genotiplərində isə aşağı düşmüşdür. Torpaq quraqlığı şəraitində arpa genotiplərində antioksidant fermentlərin elektroforetik spektrləri də tədqiq edilmişdir (Şəkil 5). Fermentlərin elektro- foretik spektrlərində nəzərə çarpacaq keyfiyyət fərqləri (elektroforeqramda əlavə xətlərin əmələ gəl- məsi və ya itməsi) aşkar olunmamışdır. Lakin kon- trol variantla müqayisədə stresə məruz qalmış arpa yarpaqlarının elektroforetik spektrlərində uyğun izoformaların intensivliyi artmışdır (Şəkil 5 və 6). Şəkil 6-dan göründüyü kimi, arpa cücərtilərinin elektroforetik spektrlərində APO-nun mütəhərrik- liyinə görə fərqlənən iki (Rf 0,89 və Rf 0,96),
Hüseynova və b. 11
katalazanın isə bir izoforması müşahidə olunmuşdur. Analoji nəticələr digər müəlliflər tərəfindən də alınmışdır (Kim et al., 2005; Domanskaya et al., 2009).
Şəkil 5. Torpaq quraqlığı zamanı arpa genotiplərinin yarpaqlarında katalaza fermentinin izoenzim tərkibi: 1- K-2778, 2- St. Pallidum 596; a – suvarılan, b – quraqlıq.
Şəkil 6. Torpaq quraqlığı zamanı arpa genotiplərinin yarpaqlarında askorbatperoksidaza fermentinin izoenzim tərkibi: 1 - K-2778, 2 – St.Pallidum 596 sortu; a – normal suvarma, b – quraqlıq; APO1, APO2 – fermentin uyğun izoformaları; R – rəngləyici.
Beləliklə, aparılan tədqiqatlar zamanı əldə olu- nan məlumatlar əsasında belə nəticəyə gəlmək olar ki, arpa genotiplərinin quraqlığa davamlılığı onların anti- oksidant müdafiə sistemi ilə sıx bağlıdır. Bəzi oksidləşmə stresi fermentlərinin fəallıqları ilə onların çoxsaylı izoenzimlərinin müqayisəli analizinin öyrə- nilməsi istiqamətində apardığımız biokimyəvi tədqi- qatlar quraqlıq şəraitində arpa bitkisində bu fermen- tlərin fermentativ fəallıqlarını qiymətləndirməyə və bu göstəricini fizioloji və morfoloji proseslərlə əlaqələn- dirməyə imkan verir. Quraqlıq zamanı antioksidant fermentlərin fəallıqlarının və izoenzim tərkibinin kə- miyyət və keyfiyyət dəyişmələri arpa bitkisinin eks- tremal şəraitdə öz həyati funksiyalarını və homeostazı qoruyub saxlamasını təmin edir. Aparılmış tədqiqat- ların nəticələri bitkilərdə quraqlığa davamlılığın qiy- mətləndirilməsi üçün yeni test sistemlərin yaradıl- masında nəzəri əsas rolunu oynaya bilər. ƏDƏBİYYAT Ahmad P., Jaleel C.A., Salem M.A., Nabi G., Sharma S. (2010) Roles of enzymatic and nonenzymatic antioxidants in plants during abiot- ic stress. Crit. Rev. Biotechnol., 30(3): 161-175.
Reactive oxygen species and antioxidants: Relation- ships in green cells. Physiol. Plant., 100: 224-233.
(Hordeum vulgare L.) affected by priming with PEG. Intl. J. Farm. and Allied Sci., 2(20): 803-808.
Metabolism, oxidative stress, and signal transduc- tion. Ann. Rev. Plant Biol., 55: 373-399.
reveals the leaf response to drought in alfalfa (Medicago sativa L.). J. Exp. Bot., 62: 111-123.
plants: Recent advances. Biotech. Adv., 28: 169. Badiani M., De Biasi M.G., Colognola M., Artemi F. (1990) Catalase, peroxidase and super- oxide dismutase activities in seedlings submitted to increasing water deficit. Agrochimica, 34: 90- 102.
Brou Y.C., Zeze A., Diouf O., Eyletters M. (2007) Water stress induces overexpression of su- peroxide dismutases that contribute to the protec- tion of cowpea plants against oxidative stress. Af- rican J. Biotech., 6 (17): 1982-1986. Domanskaya I.N., Budakova E.A., Samovich T.V., Spivak E.A., Shaligo N.V. (2009) Activi- ties of the antioxidant enzymes in green seedlings of barley (Hordeum vulgare) under drought condi- tions. Proceedings of the Academy of sciences of Belarus (Series of Biological Sciences), 4: 45-49. Faize M., Burgos L., Faize L., Piqueras A., Nico- las E., Barba-Espin G., Clemente-Moreno M.J., Alcobendas R., Artlip T., Hernandez J.A. (2011) Involvement of cytosolic ascorbate perox- idase and Cu/Zn-superoxide dismutase for im- proved tolerance against drought stress. J. Exp. Bot., 62(8): 2599-613 Fayez K.A., Bazaid S.A. (2014) Improving drought and salinity tolerance in barley by appli- cation of salicylic acid and potassium nitrate.
dants and lipid peroxidation in the adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress. Environ. Exp. Bot., 45: 105-114. Joseph B., Jini D. (2011) Development of salt stress-tolerant plants by gene manipulation of an- tioxidant enzymes. Asian J. Agric., 5: 17-27.
1a 1b 2a 2b
KAT
APO1 APO2 1a 1b 2a 2b
R-rəngləyici Rf 0,89 Rf 0,96
Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin 12
T.I., Seo Y.W., Choi K.G., Yun S.J. (2005) En- hanced antioxidant enzymes are associated with reduced hydrogen peroxide in barley roots under saline stress. Journal of Biochemistry and Molec- ular Biology, 38 (2): 218-224. Kumar C.N., Knowles N. (1993) Changes in lipid peroxidation and lipolytic and free-radical scav- enging enzyme during aging and sprouting of po- tato (Solanum tuberosum L.) seed-tubers. Plant Physiol., 102: 115-124. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural pro- teins during the assembly of the head of Bacterio- phage T4. Nature, 227: 680-685.
tolerance through drought preconditioning associ- ated with changes in antioxidant enzyme activi- ties, gene expression and osmoregulatory solutes accumulation in White clover (Trifolium repens L.). Plant Omics Journal, 6(6): 481-489 . Mhamdi A., Queval G., Chaouch S., Vanderauwera S., Van Breusegem F., Noctor G. (2010) Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exp. Bot., 61(15): 4197-220 Mittler R., Zilinskas B.A. (1993). Detection of ascorbate peroxidase activity in native gels by in- hibition of the ascorbate-dependent reduction of nitroblue tetrazolium. Ana1. Biochem., 212: 540- 546.
stress tolerance. Trends Plant Sci., 7: 405-410. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van Breusegem F. (2004) Reactive oxygen gene net- work of plants. Trends Plant Sci, 9, 1360-1385. Najami N., Janda T., Barriah W., Kayam G., Tal M., Guy M., Volokita M. (2008) Ascorbate peroxidase gene family in tomato: its identifica- tion and characterization. Mol. Genet. Genomics,
ide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol., 22: 867-880. Polesskaya O.G. (2007) Plant cell and reactive ox- ygen species. Yermakov, I.P. Ed., Moscow, 140 Raychaudhuri S.S. (2000) The role of superoxide dismutase in combating oxidative stress in higher plants. Bot. Rev., 66: 89-98.
leaves: response to abiotic stress and characteriza- tion of the peroxisomal isozyme. New Phytol.,
sion of a pepper ascorbate peroxidase-like 1 gene in tobacco plants enhances tolerance to oxidative stress and pathogens. Plant Sci., 169: 55-63. Saruhan N., Terzi N., Saglam A., Kadıoglu A. (2009) The relationship between leaf rolling and ascorbate-glutathione cycle enzymes in apoplastic and symplastic areas of Ctenanthe Setosa subject- ed to drought stress. Biol. Res., 42: 315-326.
ygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology
sitive, and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G 250. Anal. Biochem.,
(1988) Dominant pleiotropy controls enzymes co- segregating with paraquet resistance in Conyza
Dynamic changes of antioxidative enzymes of 10 wheat genotypes at soil water deficits. Colloids
mary. In: Solomon S., Qin D., Manning M., Chen Z., Marquis M., Averyt K.B., Tignor M. and Mil- ler H.L. Ed., Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fourth Assessment Report of the Intergov- ernmental Panel on Climate Change. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA.
(1971) An improved procedure using ferricyanide for detecting catalase isoenzymes. Anal.
tivity and isoforms in leaves and roots of wheat plants subjected to cadmium stress. Phytochem.,
roxidase isoenzymes in response to oxidative stresses. Plant Physiol., 123(1): 223-234.
induced changes in activities of superoxide dis- mutase, catalase and peroxidase in wheat species.
Hüseynova və b. 13
Исследование Активности и Изоферментного Состава Антиоксидантных Ферментов в Листьях Генотипов Ячменя (Hordeum vulgare L.), Подверженных Воздействию Засухи
И.М. Гусейнова 1 , М.Я. Насруллаева 2 , С.М. Рустамова 1 , Д.Р. Алиева 1 , Д.А. Алиев 1
Институт ботаники НАНА 2 Институт генетических ресурсов НАНА Засуха является одним из основных стрессовых факторов, снижающих урожайность и качество зерна растений во всем мире. Ячмень, обладая богатым генетическим разнообразием, является важным объек- том для оценки ответных реакций контрастных генотипов на неблагоприятные факторы окружающей среды. Антиоксидантный метаболизм может сыграть важную роль в ответных реакциях растений на за- суху. Главной целью данной работы являлось определение вариаций засухоустойчивости генотипов яч- меня на основе выявленных различий в уровне антиоксидантных ферментов во время засухи. Исследо- ваны активность и изоферментный состав антиоксидантных ферментов каталазы (КАТ), аскорбатперок- сидазы (АПО), глутатионредуктазы (ГР) и супероксиддисмутазы (СОД) у 4 генотипов ячменя, подвер- женных почвенной засухе. При засухе у всех генотипов наблюдалось повышение активности КАТ и СОД, и в то же время снижение активности АПО. В условиях сильной засухи общая активность ГР у ге- нотипов К 2778 и St.Карабах 7 была повышена, тогда как у генотипов №77 Local и St.Pallidum 596, на- оборот, понижена. По сравнению с образцами, выращенными при нормальных условиях, при стрессе существенных различий в изоферментном составе (образование или исчезновение новых изоформ) не наблюдалось, хотя в электрофоретических спектрах была повышена интенсивность полос соответст- вующих изоформ.
Study of the Activity and Isoenzyme Composition of Antioxidant Enzymes in the leaves of Barley (Hordeum vulgare L.) Genotypes Subjected to Drought Stress I.M.Huseynova 1 , M.Y.Nasrullayeva 2 , S.M.Rustamova 1 , D.R.Aliyeva 1 , J.A.Aliyev 1 1
2 Institute of Genetic Resourses, ANAS Drought is one of the major factors limiting the yield and quality of crops worldwide. Barley characterized by high genetic diversity constitutes a valuable source for assessment of the responses of contrast genotypes to environmental constraints. Antioxidative metabolism plays an important role in plant responses to drought. The main aim of the study was to define variations in drought-tolerance of barley genotypes based on the obtained differencies in the levels of antioxidant enzymes during the drought stress. The activities and isoform profiles of catalase (CАТ), ascorbate peroxidase (APX), glutathione reductase (GR), and superox- ide dismutase (SOD) were analyzed in four barley genotypes grown under soil drought. Drought stress caused an increase in the activities of CАТ and SOD in all studied genotypes, while APX activity decreased. The total GR activity increased substantially in genotypes K 2778 and St.Garabag 7 and decreased in №77 local and St.Pallidum 596 genotypes under severe water stress. No detectable differences were observed in the isoenzyme composition (appearance or loss of new isoenzymes) of plants subjected to soil drought in contrast to control ones. However, the bands of corresponding isoforms in electrophoretic spectra were in- tensified in stressed barley leaves. Key words: Hordeum vulgare L., drought stress, reactive oxygen species, antioxidant enzymes, isoenzyme composition Yüklə 147,67 Kb. Dostları ilə paylaş:
|