1977 bakteriofág øX174 (5386bp, 11 genes)

1977 bakteriofág øX174 (5386bp, 11 genes)

• 1977 bakteriofág øX174 (5386bp, 11 genes)

• 1981 mitochondriální genom (16,568bp; 13 prots; 2 rRNAs; 22 tRNAs

• 1986 chloroplastový genom (120,000-200,000bp)

• 1992 Saccharomyces chromosom III (315kb; 182 ORFs)

• 1995 Haemophilus influenzae (1.8Mb

• 1996 Saccharomyces celý genom (12.1Mb; přes 600 výzkumníků, 100 laboratoří)

• 1997 E. coli (4.6Mb; 4200 proteins)

• 1998 Caenorhabditis elegans (97 Mb; 19,000 genů)

• 2000 Arabidopsis thaliana (115Mb, 25-30,000 genů)

• 2001 myš (za 1 rok!)

• 2001 člověk (2 projekty)

• 2005 šimpanz, rýže

• 2006 topol

Každý ddNTP značen jinou fluorescenční barvou – 1 reakce – vše dohromady

• Každý ddNTP značen jinou fluorescenční barvou – 1 reakce – vše dohromady

• Separace dle velikosti v gelu v kapiláře – detekce fluorescence při průchodu přes čidlo

1 reakce přečte obvykle

• 1 reakce přečte obvykle

• do nedávna: 500 – 800 bp (454, Senger, Illumina)
• nově: až desítky tisíc bp (Oxf. nanopore, PacBio)

• typický genom má stovky milionů až miliardy bp

• Co s tím?

Klasická strategie (Map-Based Assembly): minimalizace objemu sekvenování

• Klasická strategie (Map-Based Assembly): minimalizace objemu sekvenování

• – třídění klonů DNA fragmentů a postupné čtení

• (původní strategie sekvenování genomu člověka)

• Whole genome shotgun (WGS) – náhodné mnohonásobně redundantní sekvenování

• – třídění dat (prvně u Haemophilus)

• Kombinace – „hierarchical shotgun“, „chromosome shotgun“

Klasická - Map-Based Assembly:

• Klasická - Map-Based Assembly:

• Detailní kompletní mapa pozic klonů (restrikční + dle koncových sekvencí genomových fragmentů)
• Časově náročné a drahé
• Ale přímo poskytuje „lešení“ (fyzickou mapu)
• pro následné sestavování sekvence

Hierarchical shotgun

• Hierarchical shotgun

• 1) knihovny velkých úseků, jejich zamapování

• BACs (bacterial artificial chromosomes):

• 100-300 kb

• YACs (yeast artificial chromosomes):

• cca 0.5-1Mb

• u velkých genomů aspoň třídění na chromozómy

• nově kombinování přístupů s dlouhým a krátkým čtením

• 2) shotgun sekvenování jednotlivých velkých úseků

z překryvných dlouhých úseků, např. BAC klonů

• z překryvných dlouhých úseků, např. BAC klonů

• rozložení jednotlivých BACs na chromozómech, případně ve vztahu k molekulárním markerům např. STS (sequence tagged sites = krátké úseky DNA známé sekvence a pozice na chromozómu)

• základ klasického sekvenování

• VELMI užitečná i k zakotvení „shotgun“ sekvencí

• rychlé
• vyžaduje 7-9X více sekvenování
• - pro dostatečný překryv fragmentů, a tedy kompletní pokrytí genomu
• problémy s repetitivní DNA
• - nejasný počet tandemových kopií
• - ruší sestavování (je-li na více místech genomu)
• počítačově náročný alignment, kompletní sestavení velkých genomů s repetitivní DNA není bez dalších informací principielně možné
• výborné pro malé genomy či další genomy již sekvenovaných druhů

Vyhledání překryvů jednotlivých sekvenčních běhů

• Vyhledání překryvů jednotlivých sekvenčních běhů

• Propojení do „kontigů“

• = vzájemně se překrývající sekvence, ze kterých lze odvodit většinovou (consensus) sekvenci

• 3. Propojení kontigů do superkontigů (příp. využití info

• o párech sekvencí = koncových úseků a jejich vzdálenosti)

• 4. Odvození výsledné genomové (consensus) sekvence

Vyhledávání genů:

• Vyhledávání genů:

• automatická predikce kódujících oblastí
• predikce sestřihu ab initio
• predikce z příbuzných sekvencí
• ověřování – EST knihovny, cDNA klony

• Predikce funkce – z experimentálně charakterizovaných homologů

hledání homologních genů

• hledání homologních genů

• analýzy (izolace) promotorových sekvencí

• analýzy repetitivních sekvencí

• snadné zamapování inserčních mutací

• kombinace s EST daty – info o expresi

• matrice pro (epi)genomy dalších jedinců (ekotypů, mutantů, …)

• - 1000 + 1 genom: http://1001genomes.org/