Klinik Uygulamalar için hplc aplikasyonları

Klinik Uygulamalar için HPLC Aplikasyonları
Serum ve Plazma Örneklerinde Fenilalanin, Tirozin ve Triptofan amino-asitlerinin Fenilketonüri Teşhis ve miktarlandırılması için HPLC siteminde UV dedektörle yapılan aplikasyon çalışması;

(Shimadzu Prominence HPLC-UV Sistemleri ile geliştirilmiştir.)
İçerik:

Fenilketonuri (PKU), fenilalanin hidroksilaz (PAH) enzimindeki bozukluktan kaynaklanan otozomal bir çekinik gen hastalığıdır. Bu enzim fenilalanin aminoasidinin, tirozin aminoasidine dönüşümünü katalize etmek ile görevlidir. PAH eksikliğinde, fenilalanin beyin dokusunda birikir ve varlığı idrarda tespit edilen fenilprüvata (fenilketon) dönüşür.
PKU için bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır ancak fenilalaninin düşük ve tirozinin yüksek miktarda bulunduğu uygun bir beslenme ile PKU kontrol altında tutulabilir. Fenilketonüri fark edilip kontrol altına alınmaz ise, beyinsel gelişimde problemlere, ileri boyutta zeka geriliğine ve hastalık nöbetlerine sebep olur. Hastalık sadece geri dönülemez duruma geldiğinde teşhis edilebildiği için erken teşhis hayati önem taşımaktadır. Gelişmiş ülkelerde bebeklerde PKU testi doğumdan hemen sonra yapılır. PKU testi genellikle HPLC yöntemi kullanılarak yapılır ancak bazı klinikler hala biyokimyasal görüntüleme programı olarak Guthrie testinini kullanmaktadırlar.


Beklenen Değerler :
3.3 mg/dL den fazla fenilanin içeren kan örneklerini ‘şüpheli pozitif’ olarak varsayılamalı ve test tekrar edilmelidir. Tekrarlanan çalışma da fenilalanin konsantrasyonu 3.3 mg/dL nin üzerinde ise tekrar numune alınarak konfirmasyon yöntemi ile tekrar edilmedilir.
Phe/Tyr molar oranı ≥2.5 ise of hiperfenilalanilemi tanısı oluşturur.


HPLC Metot Parametreleri:

HPLC-UV Parametreleri
Kolon	DİKMA-inspire C18-(50*4,6, 3um)
Enjeksiyon Hacmi	20 µL
Gradient (İzokratik)	00.00 dk 100% A 09:00 dk 100% A
Akış	0,50 mL/dk
Kolon Fırını	30 C
Dedektör	UV
Dalga boyu	214 nm

Analitik performans verileri :

Analit	LOD (µmol/L)	LOQ (µmol/L)	Doğruluk (%)	Kesinlik (%CV)	Doğrusallık (R^2)
Fenilalanin (PHE)	0,35	1,05	97	3,9	0,9895
Tritopfan (TRP)	0,60	1,80	98	3,4	0,9989
Tirozin (TYR)	0,85	2,55	97	4,9	0,9959

Numune Hazırlama Prosedürü:

Fenilalanin, Tirozin ve Triptofan asidik bir çözelti ile ekstraksiyon ve deproteinizasyon işlemleri ile numuneden ekstrakte edilirler. Ekstrakte edilen analitler HPLC-UV sisteminde analiz edilir.

• 
  50 L plazma veya serum numunesi 300 L of R1 içeren 2 ml’lik eppendorf tüpe alınır.
  
• 
  5 saniye boyunca vorteklenir ve 15 dakika 4 °C’de inkübe edilir.
  
• 
  5000 x rpm’de1 dakika santrifüj edilir.
  
• 
  200 µl üst faz oto örnekleyici viale alınır ve 20 µl HPLC-UV sistemine enjekte edilir.
  

Spike Yapılmış plasma örneğinde PKU analizi örnek kromatogramı

(Spike seviyeleri; 1mg/dl Tirozin, 1mg/dl Triptofan, 1mg/dl Fenilalanin)