Masarykova univerzita



Yüklə 149,25 Kb.
tarix17.01.2018
ölçüsü149,25 Kb.
#21489

MASARYKOVA UNIVERZITA

Přírodovědecká fakulta

Ústav biochemie

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE


Vztah mezi alelou HLA-B27 a degenerativním onemocněním bederní páteře

Brno 2011 Lucie Adamusová



Prohlašuji, že svou bakalářskou práci na téma Vztah mezi alelou HLA-B27 a degenerativním onemocněním bederní páteře jsem vypracovala samostatně a veškeré použité prameny jsem uvedla v seznamu literatury.
V Brně, dne 11. 5. 2011 …………………..............

Lucie Adamusová

Poděkování:



Ráda bych poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce doc. RNDr. Omarovi Šerému, Ph.D., za odborný dohled a vedení. Také bych ráda poděkovala Mgr.Lukášovi Častulíkovi za pomoc a dohled nad praktickou částí.

OSNOVA:


Seznam použitých zkratek 4

  1. Úvod 5

  2. Hlavní histokompatibilitní komplex 8

    1. HLA systém 8

      1. Struktura molekuly HLA I. třídy 8

      2. Genetická organizace HLA systému 9

      3. Typizace HLA systému 10

      4. Rozpoznávání molekul HLA T lymfocyty 10

      5. Zpracování endogenních cizorodých molekul a jejich prezentace prostřednictvím molekul HLA I. třídy 11

  3. HLA B27 13

    1. Struktura molekuly 13

    2. Asociace HLA-B27 s ankylosující spondylitidou 14

    3. Podtypy HLA-B27 15

  4. Ankylozující spondylitida 17

    1. Výskyt 17

    2. Klinický obraz 17

    3. Diagnóza 19

    4. Léčba 20

  5. Materiál a metodika 21

    1. Soubor osob 21

    2. Izolace DNA 21

    3. Real Time PCR 22

  6. Výsledky 23

    1. Vyhodnocení amplifikační křivky 24

    2. Statistické zastoupení HLA-B27 – Fisher exact test 26

  7. Diskuze 27

  8. Závěr 28

  9. Souhrn (Summary) 29

  10. Seznam literatury 30

Seznam použitých zkratek



APC buňka předkládající antigen (antigen presenting cell)

AS ankylozující spondylitida

β2m β2 - mikroglobulin

CD diferenciační antigen (cluster of differentiation)

ER endoplasmatické retikulum

HC těžký řetězec (heavy chain)

HLA hlavní lidský antigen (Human leukocyte antigen)

INF interferon

LMP large multifunctional protease

MECL-1 multicatalytic endopeptidase complex-like-1

MHC hlavní histokompatibilitní komplex (Major histocompatibility complex)

NK nukleová kyselina

TAP peptidový transportér (transporter associated with antigen processing)

TCR receptor T lymfocytů pro antigen (T - cell receptor)


  1. ÚVOD

Mezi nejrozšířenější degenerativní postižení zad a kloubů patří nejrůznější druhy revmatických onemocnění. Mezi tyto onemocnění také řadíme různé druhy séronegativních spondylartritid. Mezi jejich společné klinické projevy patří zánětlivá bolest v zádech, periferní oligoartritidy (zejména dolních končetin), entenzitidy a specifické orgánové postižení jako je přední uveitida, lupénka a chronické zánětlivé onemocnění střev. Séronegativní spondylartritidy mají pět podskupin, které mají odlišné klinické projevy. Z těchto podskupin má největší vazbu na alelu HLA-B27 ankylozující spondylitida (1).

Ankylozující spondylitida, neboli Bechtěrevova choroba je stará jako lidstvo samo. Důkazem toho jsou rentgenové nálezy pořízené na mumiích faraonů 18. a 19. dynastie Starého Egypta Amenhotepa II., Ramsese II. a jeho syna Merenptaha. Rentgenové snímky byly pořízeny roku 1967 a jsou na nich patrné znaky AS, jako je osifikace paraspinálních ligament apod. U Ramsese II. byla nalezena krční fraktura, která byla způsobena po smrti s účelem narovnat krk faraona před mumifikací. Při zkoumání vědci upravili virtuálně páteř do původní polohy a zjistili, že poloha páteře a postavení hlavy tohoto faraona se podobá starším pacientům s AS v dnešní době (2).

Prvním dokumentovaným případem byla kostra objevená irským studentem medicíny v Paříži roku 1691, na níž os ilium, sacrum a posledních 15 obratlů tvořilo jednu souvislou kost. Zpět do zájmu se AS dostala až v druhé polovině 19.století. Četné práce o ní napsali Fagge, Struge, Clutton a další. Nemoc však byla nozologicky ohraničena až na konci 19.století a to souhrnými pracemi Strümpella, Marieho a Bechtěreva. Dnešní název Ankylozující spondylitida pochází z práce V. Bechtěreva z roku 1893 (3). Diagnostická kritéria byla stanovena roku 1984 (4).

Ankylozující spondylitida je zánětlivé onemocnění postihující axiální kostru, což způsobuje charakteristickou zánětlivou bolest v páteři, která může vést ke strukturním a funkčním poškozením a snížení kvality života. Toto onemocnění postihuje většinou mladé muže zpravidla okolo 26 roku života (1). Silná asociace této nemoci a alely HLA-B27, která je součástí hlavního histokompatibilitního komplexu, je známá od roku 1973, nicméně mechanizmus patogeneze tohoto onemocnění je stále neznámý (5).

Cíl: Cílem mé práce bylo stanovit frekvenci alely HLA-B27, která je známá zejména ve své spojitosti s ankylozující spondylitidou, u pacientů s výhřezem meziobratlové ploténky.




  1. HLAVNÍ HISTOKOMPATIBILITNÍ SYSTÉM

Na povrchu všech buněk a zvláště pak na povrchu buněk imunitního systému, se nacházejí membránové glykoproteiny, podmiňující tkáňovou neslučitelnost mezi nepříbuznými jedinci téhož živočišného druhu, popřípadě brání přenosu tkání z jednoho živočišného druhu na druhý. Tyto molekuly se nazývají histokompatibilitní. Expozice těchto molekul vede ke vzniku imunitní odpovědi. Genetický systém, který určuje charakter těchto molekul se označuje jako MHC (Major Histocompatibility Complex). Je to obecný systém pro různé živočišné druhy, každý druh nese jiný název. Lidský je nazýván HLA systémem (Human Leukocytes Antigens) (6).


    1. HLA systém

Rozhodující prvek určující individuální imunologickou reaktivitu (6). Jeho základní funkcí je vázat peptidové fragmenty proteinů, které vznikají z exogenních nebo endogenních cizorodých částic a vystavovat je na buněčném povrchu tak, aby mohly být rozpoznány T lymfocyty, pomocí jejich antigenně specifických receptorů označovaných jako TCR (6; 7).

HLA systém je vysoce polymorfní. HLA molekuly mají ve svých genových lokusech abnormálně velké množství alel, a proto tvoří nejpolymorfnější systém v lidském těle (lokus HLA–A více než 200 různých alel, lokus HLA-B – více než 400 alel) (8). Takováto vysoká rozmanitost alel v lidské populaci umožňuje vysokou variabilitu vazby vlastních a cizích proteinů. Tato strategie snižuje riziko toho, že některé patogeny by mohly uniknout rozpoznávacímu mechanismu imunitního systému (9). Každý člověk nese na povrchu svých buněk unikátní sestavu molekul HLA (6).

Molekuly HLA a geny, které je určují, rozdělujeme do tří skupin: HLA I., HLA II. a HLA III. třídy. HLA I., II. a III. třídy se rozlišují na základě svých struktur, funkce a rozložení v tkáních (10). HLA molekuly II. třídy se nacházejí jen na povrchu buněk imunitního systému a zejména na lymfocytech, zatímco HLA molekuly I. třídy jsou na povrchu všech jaderných buněk. Molekuly HLA III. třídy kódují např. některé cytokiny nebo enzymy a jejími produkty nejsou typické HLA-antigeny (8).


      1. Struktura molekul HLA I.třídy

Je tvořena transmembránovým glykoproteinem I. typu. Je to heterodimer skládající se z membránově vázaného řetězce α, který je nekovalentně vázán s řetězcem β. β řetězec je tvořen β2 – mikroglobulinem (β2m), jež je zakotven v cytoplazmatické membráně. α řetězec se skládá z C proximální domény α3 a N-koncových domén, které jsou tvořeny dvěma α helixy. Ty vystupují nad plošný útvar, který je tvořen osmi antiparalelními β řetězci, čtyřmi z domény α1 a čtyřmi z domény α2. Celá tato struktura poté vytvoří žlábek, kde se váže antigenní peptid (obr.1) (6).

Antigen


Obr. 1: Schematické znázornění molekuly HLA I. třídy (11)


      1. Genetická organizace HLA systému

HLA systém je kódován komplexem genů, které se nacházejí na krátkém raménku 6. chromozómu. Tento systém je také označován jako HLA-komplex. Obsahuje více než 200 různých genů, představujících asi 0,1 % genomu člověka (8), z nichž asi 40 kóduje molekuly exprimované na buňkách imunitního systému a zbylé nesouvisí s vlastními HLA geny. Je to unikátní oblast s vysokou koncentrací genů na relativně krátkém úseku DNA (6).

Geny, které kódují molekuly HLA se člení do tří tříd: HLA I., HLA II. a HLA III. třídy. I. třída zahrnuje zhruba 20 genů, z nichž nejdůležitější jsou HLA A, HLA B a HLA C, což jsou klasické geny této třídy. Kódují α řetězce, které se uplatňují v prezentaci antigenních fragmentů CD8+ T lymfocytům (6). HLA-E, HLA-F a HLA-G patří mezi neklasické MHC molekuly I. třídy a někdy se také označují jako CD1. Jsou strukturně podobné klasickým genům, ale jsou mnohem méně polymorfní a zpravidla se vyskytují jen na některých buňkách, kde se specializují na vazbu zvláštních ligandů (7). Například komplexy HLA-E a HLAG jsou schopny inhibovat cytotoxickou aktivitu NK buněk. Patří zde i geny molekulové rodiny MIC, MIC A a MIC B, které sehrávají úlohu v rozvoji slizniční imunitní odpovědi (6).


      1. Typizace HLA systémů

Je znám dvojí přístup k zjišťování HLA výbavy určitého člověka. Prvním je fenotypizace, tzv. sérotypizace, která využívá typizační séra, ty potom identifikují konkrétní HLA molekuly tzn. bílkoviny. Základním zdrojem typizačních sér je krev matek, které porodily dvě a více dětí s jedním biologickým otcem. V takovém séru je potom dostatečné množství protilátek namířených proti HLA molekulám plodu, které se dědí po otci. K expresi konkrétních molekul HLA se využije mikrocytotoxického testu (6).

Druhý způsob je pomocí genotypizačních vyšetření, ke kterému je nutné mít k dispozici specifické primery. DNA se izoluje z krve nebo bukální tkáně a poté se provede PCR. Jsou dva typy a to Low resolution – kdy se identifikuje skupina alel sdílejících stejné polymorfní sekvence a High resolution – což je identifikace individuálních alel. Tato metoda je časově náročnější, ale přesnější (6).


      1. Rozpoznávání molekul HLA T lymfocyty

T lymfocyty jsou zásadní pro antigenně specifické buněčně zprostředkované i protilátkové imunitní reakce. Každý T-lymfocyt nese na svém povrchu několik desítek tisíc unikátních receptorů, označovaných jako TCR. Tyto receptory se skládají z modulu rozeznávající antigen a z asociovaného komplexu několika proteinů, označovaného jako CD3 komplex. CD3 komplex je podstatný pro přenos signálu. Při rozpoznávání antigenu na MHC molekulách spolupracují TCR také s koreceptory CD4 (reagují s HLA II. třídy) a CD8 (reagují s HLA I. třídy) (7).

T lymfocytární odpověď se rozvine pomocí interakce T lymfocytů a antigenem prezentujících buněk (APC = antigen presenting cell), kterou provází sestavení multifunkčních signálních komplexů. APC mají schopnost zpracovat antigen, navázat ho na molekuly HLA I. nebo II. třídy v podobě antigenních fragmentů a prezentovat tyto fragmenty T lymfocytům. Mezi APC patří dendritické buňky, makrofágy a B lymfocyty (6).


      1. Zpracování endogenních cizorodých molekul a jejich prezentace prostřednictvím molekul HLA I. třídy

Primární strukturou se HLA molekuly I. a II. třídy liší v N-koncové části mezi různými lidmi. HLA molekuly se vazbou antigenních fragmentů stabilizují, jinak jsou totiž endocytovány a rozkládány (6). Vazebné místo MHC molekul I. třídy je charakterizováno třemi strukturními kritérii pro peptidové ligandy: 1) délka peptidového ligandu je limitována od 8 do 10 aminokyselin s převahou nonamerních peptidů. 2) Jeden nebo dva postranní peptidové řetězce, označované jako kotvy, zapadají do odpovídajících specifických kapes, které se nacházejí ve vazebném žlábku. Pozice a shoda těchto kotevních reziduí se liší mezi jednotlivými molekulami MHC I. třídy. 3) Peptidy jsou fixovány pomocí vodíkových vazeb svými amino- a karboxylovými konci ve vazebném žlábku (9).

Proces tvorby peptidů je složitý, mnohastupňový a enzymaticky katalyzovaný. Jako příklad cizorodých antigenů si můžeme uvést například virové antigeny. Virové ribonukleové buňky se překládají na ribozomech hostitelské buňky. Zde se syntetizují virové polyproteiny (6). Tyto polyproteiny se označí k likvidaci připojením několika sřetězených molekul polypeptidu ubikvitinu (polyubikvitinace) (10). Po této vazbě je protein určen k proteolytické degradaci v proteazómu, což je složitá buněčná organela, která zajišťuje převážnou část proteolytických procesů v buňce (6). Tento multikatalytický proteinázový komplex je lokalizován v cytosolu a jádru a obsahuje 28 podjednotek, které formují centrální kanál, kde se neposkládané polypeptidy štěpí na krátké peptidy. V přítomnosti INF – γ se katalytická aktivita proteazómu změní v důsledku nahrazení tří základních jednotek za nové podjednotky označované jako LMP (LMP 2, LMP7 a MECL – 1). Proteazóm, který obsahuje tyto nové podjednotky se nazývá imunoproteazómem a začne tvořit antigenní peptidy s hydrofóbními nebo bazickými C-terminálními konci. Takovéto peptidy mají potom větší pravděpodobnost vazby na molekuly HLA I. třídy (9).

TAP, membránový transportér, přenese antigenní fragmenty od imunoproteazómu do endoplazmatického retikula, aby se mohly navázat na molekuly HLA. Po navázání antigenního peptidu se HLA molekula uvolní do lumenu ER (6). Po zpracování v Golgiho aparátu se poté objeví na povrchu antigen prezentující buňky (10). Zde jsou rozpoznávány CD8+ cytotoxickými T lymfocyty. Jejich aktivitou jsou buňky infikované virem cytotoxicky likvidovány a tím se zabraňuje replikaci virů (Obr.2) (6).

Buňky, které nejsou infikovány virem, mají svá vazebná místa pro antigenní peptidy na molekulách HLA obsazované štěpy, vznikajícími proteolytickou degradací vlastních molekul. V případě virové infekce jsou antigenní fragmenty vzniklé z vlastních molekul nahrazeny antigenními fragmenty cizorodého agens (6).




Obr.2: Zpracování a prezentace antigenu. Kompletování MHC molekul I. třídy je zahájeno v endoplazmatickém retikulu. a) Nově syntetizovaná molekula MHC I. třídy těžkého řetězce (Heavy chain - HC) váže membránově vázaný chaperon známý jako calnexin, který udrží MHC molekuly I. třídy v částečně složeném stavu v ER. b) Vazba β2- mikroglobulinu (β2-m) na těžký řetězec disociuje calnexin a HC - β2-m heterodimer se následně váže na komplex proteinů, z nichž jeden c) careticulin je také chaperonem. d) Transporter tapasin se váže na TAP 1 podjednotku TAP komplexu. Spojení tapasinu s HC - β2-m umožňuje heterodimeru počkat na vhodný peptid. e) Cytosolové proteiny určené ke zničení jsou degradovány proteazómem, z něhož vychází peptidy o 8-10 zbytcích, nejčastěji nonamery, které jsou vhodné pro prezentaci MHC I. třídy. f) Tyto peptidy jsou translokovány do ER TAP komplexem. g) Když se peptidy navážou na HC - β2-m heterodimer, molekuly MHC I. třídy se správně poskládají a opustí ER, h) při vstupu do sekreční cesty jsou uloženy na povrchu antigen prezentující buňky. Peptidy jsou rozpoznávány specifickou třídou CD8+ T buněk a iniciují imunitní odpověď proti patogenům (12).


  1. HLA-B27

HLA-B27 je součástí hlavního lidského histokompatibilitního komplexu (MHC), kde se řadí mezi molekuly HLA I. třídy. HLA-B27 je zejména znám svou asociací s revmatickými onemocněními, mezi něž patří i různé typy séronegativních spondylartritid, u kterých je největší spojení známo s AS (kolem 95 % v populaci centrální a severní Evropy HLA pozitivních jedinců) (13). Kromě AS, se ve vysoké míře objevuje například u reaktivní artritidy (Reiterův syndrom, 70-90 %), psoriatické artritidy se sarkoileitidou (50-60 %), infekční enteritidy a enterokolitidy s reaktivní artritidou (80-90 %) atd. (14).


    1. Struktura molekuly

Molekula HLA-B27 patří mezi molekuly HLA I. třídy. Jedná se tedy o heterodimer, obsahující HLA-B α (těžký) řetězec membránového glykoproteinu ~44 kDa nekovalentně vázaný na lehký řetězec ~12 kDa, nazvaný β2-mikroglobulin (β2m). Těžký řetězec má tři dobře rozlišitelné strukturní regiony: vysoce hydrofilní intracytoplazmatický konec o cca 30 AMK, hydrofóbní transmembránový region o cca 25 AMK a extracelulární region, který obsahuje žlábek, kde se vážou peptidy. Peptidové vazebné žlábky nejsou v homogenním prostoru. Jsou zde také boční kapsy (šest celkově, značených od A po F, které váží aminokyselinové řetězce peptidů lokalizovaných ve žlábcích (obr. 3) (12).

HLA-B27 jsou od ostatních molekul I. třídy unikátní ve své B kapse, která pojme ze zbytku postranního řetězce v pozici 2 vázaný peptid (15). Předpokládalo se, že B kapsa váže převážně peptidy s argininem v P2, ale současné studie ukazují, že může vázat také glycin a histidin (12).

HLA-B27 vážou a předkládají peptidy CD8+ T buňkám s vysokou účinností a jsou asociovány s poměrně lepší ochranou před virovými nemocemi, jako je chřipka nebo AIDS, než ostatní HLA alely (16).

α2 Doména


α3 Doména

β2 - Mikroglobulin

α1 Doména

Peptid



Obr. 3: Struktura HLA-B27 (12)


    1. Asociace HLA-B27 s ankylozující spondylitidou

Dlouhou dobu se tradovala domněnka, že AS není imunologickým onemocněním, protože chyběly relevantní laboratorní důkazy. Až v poslední době se mimo jiné zjistilo, že molekula HLA-B27 na buňkách prezentujících antigen prezentuje T lymfocytům imunogenní peptid, čímž spustí zánětlivou kaskádu. Klíčovou úlohu v zánětlivém procesu mají protizánětlivé cytokiny, označované TNF-α (17).

Antigen HLA-B27 byl prokázán u více než 90 % nemocných, v kontrolních vzorcích to bylo jen 6-8 % případů (3). Je uvedeno, že 20 % HLA-B27 pozitivních pacientů onemocní AS (18). U 20 – 25 % příbuzných, kteří zdědili holotyp s antigenem HLA-B27, se vyskytuje AS, nebo některé jiné onemocnění ze skupiny séronegativních spondylartritid, přičemž u mužů je riziko dvakrát tak vyšší (3).

AS je sice silně asociována s genem HLA-B27, ale jen 1-5 % B27 pozitivních jedinců onemocní AS. B27-pozitivní příbuzní pacientů, kteří trpí AS, mají riziko onemocnění 5,6 až 16 krát vyšší než B27-pozitivní jedinci v populaci. Jednovaječná dvojčata mají větší náchylnost k onemocnění (68%) než dvojvaječná dvojčata (23%). Tyto všechny tvrzení podporují názor, že kromě HLA-B27 musí být zapojeny i další geny podílející se na vzniku nemoci (19).

Dosavadní studie nepodporují jednoduchý mendelovský typ dědičnosti. Patogeneze AS je složitou souhrou mezi vnitřními faktory (hlavně genetickými) a vnějšími faktory (pravděpodobně infekce), přičemž patogenetické důsledky jsou zprostředkovány imunologicky (humorálně i buněčně). Přesná úloha antigenu HLA-B27 v patogenezi AS zatím není doposud zcela objasněna (3).


    1. Podtypy HLA-B27

V současné době je charakterizováno asi 46 HLA-B27 podtypů (obr.4) (19). Podtypy se liší navzájem záměnou jedné nebo více aminokyselin a to zejména v exonech 2 a 3, které kódují α1 a α2 domény. Mezi podtypy se nalézají i takové, které nejsou asociovány s AS, a proto se od jejich studia očekává, že poskytují vodítka k pochopení mechanismu souvisejícího s nemocí. Dalším důvodem ke studiu podtypů HLA-B27 jsou efekty sekvenční variability ve vztahu k vazebné specifitě na peptidy (15).

Celosvětová populační studie ukazuje, že mezi široce produkovanými podtypy jsou B*2702, B*2704 a B*2705 silně asociovány s AS (16).

B*2705 je považován za původní podtyp, z něhož ostatní vznikly. Je rozšířen téměř ve všech populacích světa, ale jeho výskyt je rozdílný mezi jednotlivými oblastmi. Je zde patrný severojižní pokles v distribuci tohoto podtypu, který mohl být způsoben pohybem obyvatelstva mezi severní Evropou a Asií (12). Je vysoce asociován s AS s výjimkou západoafrické populace, Senegalu a Gambie. Je to také prakticky jediný podtyp vyskytující se mezi domorodým obyvatelstvem východní Sibiře a Severní Ameriky a je přítomen  přibližně u 90 % HLA-B27 pozitivních jedinců v severní Evropě (15).

B*2704 je převládajícím podtypem v Asii mezi Číňany a Japonci a je silně asociován s AS (15). Zdá se, že tento podtyp mohl vzniknout v čínské populaci z B*2705 a rozšířit se odtud do Asie a na Tichomořské ostrovy (12). B*2704 může být předchůdce, z kterého vznikly B*2706 a další vzácné asijské podtypy (např. B*27011, B*27015 nebo B*2720) (15).

B*2702 je přítomen přibližně u 10 % HLA-B27 pozitivních jedinců severoevropského původu, u 20 % jedinců na Pyrenejském poloostrově (Španělsko a Portugalsko) a u 48 % v HLA-B27 pozitivních semitských (Arabové a Židé) populacích (15).

B*2706, která je docela běžná u HLA-B27 pozitivních jedinců v jižní Asii (Thajsko, Malajsie) a B*2709, zejména pozorovaný na Sardinii, nejsou asociovány s AS. B*2706 se odlišuje od B*2704 záměnou aminoskupiny jen ve dvou reziduích a to 114 a 116 na těžkém řetězci (16). B*2709 se odlišuje od B*2705 jedinou aminokyselinou a to ve zbytku 116 na těžkém řetězci (asparagin místo histidinu u B*2709). Bylo také prokázáno, že B*2705 a B*2709 mohou vázat ty samé peptidy, ale v odlišné konformaci (13). Zjištění, že tyto dva podtypy, které nejsou asociovány s a AS a přitom jsou velmi podobné dvěma podtypům, které jsou s AS asociovány velmi silně, podporuje hypotézu molekulární mimikry, jež nabízí možné vysvětlení pro to, jak by mohlo AS vznikat (16).

Kromě B*2706 a B*2709 byly objeveny ještě další dva podtypy, které zřejmě nesouvisejí s AS. Jedná se o podtyp B*2708 vyskytující se ve Venezuele a B*2707 na Kypru. Výsledky však nejsou jednoznačné, neboť ty samé alely byly nalezeny v jiných populacích u pacientů s AS. Toto tvrzení bude tedy potřeba ještě potvrdit (13).

Obr. 4: Celosvětové rozšíření HLA-B27 podtypů a jejich asociace s AS (13)


  1. ANKYLOZUJÍCÍ SPONDYLITIDA

Ankylozující spondylitida, která bývá také označována jako Bechtěrevova choroba, je systémové zánětlivé onemocnění pohybového ústrojí patřící do skupin séronegativních spondylartritid. Postihuje zejména axiální skelet (osová část kostry, tj. páteř a kostra hrudníku), sakroiliakální (kloub mezi kostí křížovou a pánví (20)), apofyzeální a kostovertebrální klouby páteře (18). V polovině případů bývají postiženy ramenní a kyčelní klouby a přibližně ve 20 % případů jiné klouby končetin. Nemoc může být také doprovázena mimokloubními projevy – očními, kožními, slizničními, gastrointestinálními a urogenitálními (4).


    1. Výskyt

Plně vyvinutý obraz AS se nachází převážné u mužů (0,5 %). U žen se vyskytuje jen u 0,05 %. Muži jsou tedy postiženi 7-10x častěji než ženy (18). Odhaduje se, že u přímých příbuzných s pacienty s AS se vyskytuje choroba asi 20x častěji než v běžné populaci. Nemoc začíná většinou koncem druhého a ve třetím decenniu, začátek po 35. roce života je vzácný a po 40. onemocnění zpravidla nezačíná (3). Ve studiích z různých zemí se zhruba ve střední Evropě AS vyskytuje u 0,5-14 lidí na 100 000 obyvatel (1). Onemocnění je vysoce dědičné v rodině. Sourozenci mají více jak 50x větší risk onemocnění, než jedinci v normální populaci (19).


    1. Klinický obraz

Nemoc začíná pozvolna nevýraznou bolestí v křížobederní oblasti. Zpočátku je nepravidelná, ale později se stává trvalou (3) a postupně nabývá charakteru zánětlivé páteřní bolesti, což znamená, že největší obtíže má nemocný v klidu (18). Objevuje se hlavně v noci a před probuzením. Je doprovázena pocitem ranní ztuhlostí. Bolest může zasahovat i hýžďovou svalovinu nebo slabiny a mění svou intenzitu a lokalizaci (3). Poměrně častým úvodním projevem AS je epizodická artritida periferních kloubů (10 - 15 %), hlavně v oblasti velkých kloubů dolních končetin (18) jako jsou kyčle – koxitida (zánět kyčle) nebo kolena (4). Pro AS jsou také typické entezitidy (18), což jsou zánětlivá onemocnění úponu šlach ke kosti (20), nejčastěji v oblasti úponu Achillovy šlachy. Entezitidy se projevují citlivostí na tlak a prudkou bolestí při určitých pohybech (18).

Dalším závažným klinickým znakem je omezení pohyblivosti. Charakteristická pro AS je omezení pohyblivosti páteře ve třech rovinách. Jako první nejčastěji začíná mírné omezení záklonu, postupně se omezují i rotační a boční pohyby bederní a hrudní páteře jako jsou úklony. Pro měření rozsahu pohyblivost páteře se využívá Schoberovy, Stiborovy a Ottovy distance (3).

Významné je i omezení kostovertebrálních kloubů, které zmenšují dýchací pohyby hrudníku. Za jednoznačně patologický se pokládá rozdíl mezi výdechem a vdechem 2,5 cm a nižší. Při postupném znehybnění hrudníku se přenáší těžiště ventilace na brániční dýchání, které se stává intenzivnějším (3).

Při rozšíření na krční páteř se omezuje pohyblivost hlavy. Nejdříve jsou omezeny rotační a poté boční pohyby (úklony). S omezením pohyblivosti páteře souvisí její deformace, mezi kterou patří hlavně různý rozsah hrudní hyperkyfózy (3), kterou označujeme - tzv. kulaté záda způsobené zvětšením vyklenutí hrudní páteře (21), v krčním úseku předsun hlavy a u části případů i fixace v různém stupni úklonu (3).

Postoj pacienta AS je typický vysunutí hlavy, větší hrudní kyfóza, ohnutá ramena, vyrovnaná bederní lordóza (přirozené prohnutí páteře), atrofie hýžďového svalstva, oploštění hrudníku a vyklenutí břišních kontur (obr.5 a 6) (3).





Obr. 5: Osifikace obratlů (22) Obr. 6: Postoj pacienta u AS (23)
Choroba může být doprovázena i extraspinálními (mimokloubními) projevy. Nejčastěji se objevuje uveitida (asi u 30 % nemocných) (18), což je zánět živnatky v oku (duhovka, řasnaté tělísko a cévnatka) (obr.7) (20). Méně časté jsou pak kardiální postižení (1-5 %) jako je aortitida (zánět aorty) (4). Zhruba u 4-6 % nemocných se objevuje amyloidóza (18) onemocnění, při němž je ukládána bílkovina amyloid do prostoru mezi buňky a do okolí cév různých orgánů jako je srdce nebo ledviny (20), patří mezi příčiny úmrtí nemocných s AS (4).
as2

Obr. 7: Uveitida (24)


    1. Diagnóza

Je postavena na diagnostických kritérií z roku 1984. Za prvé musí být splněno radiologické kritérium, tedy nález sakroileitidy (zánět sakroiliakálních kloubů) na rentgenu. Za druhé musí být nalezeno alespoň jedno ze tří následujících kritérií:

  1. bolest zad zánětlivého charakteru

  2. omezení hybnosti páteře ve 3 rovinách

  3. omezení dýchacích pohybů hrudníku na 2,5 cm nebo méně

Důležitými zobrazovacími metodami pomáhající diagnostikovat zánětlivé změny je magnetická rezonance a RTG. Sakroileitida se na snímcích projevuje nepravidelným průběhem kloubní štěrbiny, erozemi v průběhu štěrbin a finálně ankylózou (4), což je vazivové nebo kostěné spojení způsobující ztuhlost až nepohyblivost kloubu (20). Na vyšším stupni páteře jsou potom viditelné syndesmofyty – jemné, oblé osifikace periferních oblastí meziobratlových plotének (4). Spojení obratlů sysdesmofyty a kalcifikace laterálních ligament vede k typickému tvaru „bambusové tyče“ (obr 8. a 9.), který lze vidět na RTG (24). Vyšetření může být doplněno i laboratorními testy na přítomnost genu HLA-B27.
http://1.2.3.11/bmi/www.radswiki.net/main/images/thumb/0/0a/ankylosing-spondylitis-002.jpg/363px-ankylosing-spondylitis-002.jpgfile:ankylosing-spondylitis-001.jpg


Obr. 8: „Bambusová páteř“ (25) Obr. 9: „Bambusová páteř“ (25)


    1. Léčba

Základem léčení AS je pohybová terapie, fyzioterapie a lázeňská léčba. Z léků se nejdříve použijí nesteroidní antirevmatika. Když jsou postiženy periferní klouby, volíme modifikující léky (sulfasalazin). Kortikoidy se podávají výjimečně. U vysoce aktivních forem, kde selhala základní léčba, se mohou nasadit blokátory TNFα, které jsou součástí tzv. biologické léčby (18).


  1. MATERIÁL A METODIKA

    1. Soubor osob

Do souboru bylo zahrnuto celkem 140 pacientů mužského pohlaví s výhřezem meziobratlové ploténky, kteří byli operováni na neurochirurgické klinice FN Brno. Pacienti pocházeli z věkové kategorie 16 až 75 let, průměrný věk pacientů byl 46 let. Všichni pacienti měli neurologickou symptomatologii, která je dovedla od praktického lékaře k neurologovi, který diagnostikoval dráždění, ať už v bederní či krční oblasti, dále měli i bolesti v zádech, které trvaly řádově několik měsíců až let. U většiny pacientů byla z diagnostických důvodů provedena magnetická resonance nebo CT páteře, u všech pacientů bylo provedeno RTG vyšetření páteře. Spádovou oblastí pro nábor pacientů byla Morava.

Kontrolní soubor tvořilo celkem 86 mužů, kteří byli léčeni pro jiná onemocnění než onemocnění pohybového aparátu. Muži byli ve věku 32 až 61 let s průměrným věkem 51 let. U osob kontrolního souboru bylo vyloučeno postižení páteře prostřednictvím vyšetření a osobní anamnézy.


    1. Izolace DNA

Izolace DNA z krve byla prováděna pomocí komerčního izolačního kitu Ultra Clean Blood Spin DNA (Mo-Bio, USA).
Složení kitu a funkce jeho složek:

Proteináza K – narušuje buněčné stěny a napomáhá rozkladu buněk

Roztok B1 (Guanidin HCl/Tween roztok) lyzační roztok, obsahuje chaotropní soli a detergent, rozbíjí otevřené buňky

Roztok B2 (100% etanol) precipituje denaturované proteiny

Roztok B3 (Etanol/Guanidin HCl roztok) promývací roztok na bázi solí, promývá navázanou DNA

Roztok B4 (Etanol/Tris, NaCl) promývací roztok na bázi etanolu, promytí DNA a kompletní odstranění solných příměsí



Roztok B5 (10 mM Tris-HCl)eluční roztok, uvolnění DNA z filtru

Postup izolace DNA:

Do připravených mikrozkumavek bylo napipetováno 10 µl proteinázy K a 200 µl nesražené krve. Poté bylo přidáno 200 µl roztoku B1. Po 15-ti minutách na vortexu byly mikrozkumavky vloženy do termotřepačky (Biosan), která byla vytemperována na 65°C. Třepání bylo nastaveno na 700 rpm a inkubovali se 20 min. Poté byly mikrozkumavky krátce stočeny na centrifuze. Po přidání 200 µl roztoku B2 se směs vortexovala 15 sekund a poté krátce zcentrifugovala. Veškerý obsah mikrozkumavky byl poté přenesen do kolonky a centrifugoval se 1 min. při 14 000 x g. Kolonka se přendala do nové mikrozkumavky a poté do ni bylo napipetováno 500 µl roztoku B3. Kolonka se zcentrifugovala 30 sekund při 14 000 x g. Kolonka byla vyjmuta z mikrozkumavky, její obsah se vylil do odpadu a poté byla vrácena zpět. Následně do ni bylo přidáno 500 µl roztoku B4 a centrifugovalo se 30 sekund při 14 000 x g. Kolonka byla vyjmuta z mikrozkumavky, její obsah se vylil do odpadu, byla vrácena zpět a znovu se centrifugovalo 30 sekund při 14 000 x g. Opatrně, aniž bychom se dotkli roztoku B4 na dně zkumavky, byla kolonka přenesena do nové mikrozkumavky. Roztok B5 se inkuboval asi 5 minut na termotřepačce při 65°C. Poté bylo 50 µl tohoto předehřátého roztoku napipetováno do středu kolonky a 5 minut se nechal stát. Po 5 minutách byl roztok centrifugován 1 min. při 14 000 x g. Kolonka byla odstraněna a víčko zkumavky bylo uzavřeno. Izolovaná DNA zůstala uvnitř zkumavky a mohla být použita pro různé aplikace.


    1. Real Time PCR

K detekci alely HLA-B27 byl využit automatizovaný systém Real Time PCR ABI7300 (Applied Biosystems).
Primery a proby použité pro RT-PCR reakci:

B27 – forward primer

B27 – reverse primer

SYP – forward primer (kontrola)

SYP – reverse primer (kontrola)

B27 – probe (FAM)

SYP – probe (YAKIMA)
Reakční směs:

10 µl KAPA PROBE FAST qPCR Mastermix; 0,05 µl každého z primerů (100 µM); 0,03 µl obou sond (100 µM); 9,9 µl PCR vody; 5 µl genomové DNA
Reakce i detekce byla prováděna pomocí automatizovaného systému

PCR-Real Time ABI7300. Po počáteční denaturaci, která trvala 3 minuty při 95°C byla DNA amplifikována ve dvoukrokových cyklech 45x:

Denaturace 15 s při 95°C; annealing 35 s při 58°C
Přítomnost alely HLA-B27 byla detekována v kanále FAM (6-carboxyfluorescein), kontrolní DNA v kanále YAKIMA.

Výsledky potom byly statisticky zpracovány pomocí dvoustranného Fisher exact testu.


  1. VÝSLEDKY

    1. Vyhodnocení amplifikační křivky

Na amplifikační křivce, která poznamenala přítomnost alely HLA-B27, překročilo emisní spektrum fluorescenční práh (Threshold) u kanálu FAM před 45. cyklem (Graf č.1). Zároveň musí být i pozitivní nárůst spektra charakteristického pro inhibiční kontrolu v kanále Yakima Yellow.

Pokud byla HLA-B27 negativní, tak došlo k nárůstu emisního spektra pouze v kanálu Yakima Yellow, který byl kontrolní (Graf č.2).

V případě, že nedošlo k nárůstu emisního spektra specifického pro alelu HLA-B27 (FAM) a rovněž nedošlo k nárůstu u inhibiční kontroly v kanále Yakima Yellow, bylo pravděpodobně izolováno nedostatečně množství DNA a bylo potřeba celý proces včetně izolace DNA z nového vzorku zopakovat.



Graf č.1: Příklad pozitivního vzorku na alelu HLA-B27. V „Detectoru“ je zobrazeno „All“, tzn. že je zobrazený i kanál FAM. Vedle inertní kontroly je vidět i pozitivní alelu na HLA-B27.






Graf č.2 : Interní kontrola, která prokazuje schopnost amplifikace DNA každého vzorku, byla pozorovatelná v kanále Yakima Yellow.

    1. Statistické zastoupení HLA-B27 – Fisher exact test




Přítomnost alely HLA-B27

skupina

Počet osob s/bez alely HLA-B27

Přítomnost alely HLA-B27 [%]

pozitivní

negativní

celkem

K

11

75

86

12,8

P

25

115

140

17,86

celkem

36

190

226

F.test = 0,35

K – kontrolní osoby; P – pacienti s výhřezem meziobratlové ploténky; F.test – Fisher exact test


OR = 1.5584; 95% Cl of OR = 0.9522 až 2.5506

OR = Relativní riziko odds ratio. Odhad RR na základě poměru.

Vyjadřuje nezávislost dvou parametrů, tj. jak moc je pravděpodobné, že pacienti budou mít vyhřezlou ploténku, když mají alelu HLA-B27.

RR = 1.0832; 95% Cl of OR = 0.9944 až 1.1799



RR = risk ratio. Relativní riziko v prospektivních studiích. Kolikrát daná alela zvyšuje nebo snižuje vznik onemocnění.
Dvoustranný Fisher exact test p = 0,35 (p ˃ 0,05) → není zde statisticky významný rozdíl v alelických frekvencích. S ohledem na data lze tedy říct, že alela HLA-B27 nesouvisí s výhřezem meziobratlové ploténky.


  1. DISKUZE

Degenerativní onemocnění páteře sužují lidstvo od nepaměti. Důkazem toho jsou rentgenové nálezy na pozůstatcích egyptských faraónů. Z těchto nálezů je patrné, že i tito mocní panovníci byli sužováni ankylozující spondylitidou, která patří do skupiny séronegativních spondylartritid (2; 1). Tato skupina onemocnění má své společné znaky a také mnoho projevů, ve kterých se výrazně liší. Pro ankylozující spondylitidu jsou zřejmě nejtypičtějšími znaky zánět sakroiliakálního kloubu, entenzitidy, omezení hybnosti ve třech rovinách páteře a „bambusová“ páteř (1).

Roku 1973 nastal zlom v patogenezi ankylozující spondylitidy, kdy byla objevena silná vazba na alelu HLA-B27. Od té doby byla zjištěna silná asociace antigenů HLA-systému s více než 40 chorobami (26).

Lidský HLA-systém byl objeven v padesátých letech. Je rozdělen do tří tříd: HLA I. třídy, HLA II. třídy a HLA III. třídy. Jednotlivé třídy mají rozdílné funkce a rozdílnou stavbu svých molekul. Alela HLA-B27 je součástí HLA-I. třídy, jejichž funkcí je nabízet zpracované antigenní fragmenty buňkám T CD8+, které způsobí cytolýzu virem infikovaných buněk (10).

Séronegativní spondylartritidy nejsou jediným závažným onemocněním zad. Kromě nich se u lidí setkáváme s různými dalšími revmatickými onemocněními a nejrůznějšími degenerativním poruchami, mezi než také patří vyhřeznutí meziobratlové ploténky.

Vyhřeznutí ploténky je vzácné u mladých lidí, frekvence této nemoci roste s věkem (27). Meziobratlové ploténky jsou tvořeny na povrchu fibroelastickou hmotou (anulus fibrosus), která chrání gelovité jádro (nucleus pulposus). V průběhu života ploténka dehydratuje, je méně pružná a odolná a to může vést k zevnímu vyklenování nebo vnějšímu výhřezu (jinak také herniace nebo prolaps) (28). V degenerovaných discích byly nalezeny ve větším počtu Th17 buňky, u kterých je popsán vztah k  autoimunitním onemocněním, jako je např. revmatoidní artritida. Kromě Th17 buněk jsou ve vyhřezlých ploténkách známy i vyšší hladiny IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 a interferonu α - (IFNα). Tyto nálezy naznačují, že vyhřeznutí meziobratlové ploténky není způsobeno čistě mechanicky, tzn. těžkou prací a špatným postojem těla, ale také imunologicky (27).

Naší myšlenkou bylo to, že do patogeneze tohoto onemocnění by mohla být zapojena také alela HLA-B27, která má vztah s celou řadou revmatických onemocnění postihující zejména záda. Naše nálezy ale tuto teorii nepotvrdily. Ze 140 pacientů s výhřezem ploténky, byla alela HLA-B27 nalezena u pouhých 25, což je 17,86 %. U kontrol byla alela HLA-B27 nalezena u 14,9 %. Výsledky byly poté vyhodnoceny dvoustranným Fisher exact testem. Nulovou hypotézou byl předpoklad, že pacienti s alelou HLA-B27 mají větší riziko možnosti výhřezu meziobratlové ploténky. Jelikož výsledek našeho Fisher exact testu byl 0,35, tzn. že p˃0,05, nulová hypotéza se pro nás nepotvrdila. Všechny výsledky tedy naznačují to, že není rozdíl v zastoupení alely HLA-B27 mezi skupinou kontrolních osob a pacientů.

Ve studiích bylo potvrzeno, že výhřez meziobratlové ploténky je ovlivněn také imunologicky. Náš názor, že by se tohoto imunologického působení mohla účastnit i alela HLA-B27 nebyl potvrzen. Bude tedy potřeba dalších testů směrovaných jinými směry, aby byla přesná patogeneze tohoto onemocnění odhalena.


  1. ZÁVĚR

Lidé jsou postiženi nerůznějšími onemocněními. Velkou skupinou těchto nemocí jsou také různá degenerativní onemocnění bederní páteře. Mezi tyto nemoci může patřit jak vyhřeznutí meziobratlové ploténky, tak různé revmatické onemocnění, včetně autoimunitních chorob jako je ankylozující spondylitida. O všech těchto nemocích víme, že jsou, některé jsme schopni léčit chirurgickými zákroky, ale všechny mají společné to, že stále neznáme jejich přesnou patogenezi.

Nejnovější poznatky o výhřezu meziobratlové ploténky jasně vyplývá, že je toto onemocnění také spjato s imunologickou aktivitou, která je podobná jako u některých autoimunitních revmatických onemocnění. Alela HLA-B27 je známá svou asociací s velkým počtem těchto autoimunitních onemocnění, a proto se stala objektem našeho zájmu. Nicméně z výsledků našich testů vyplývá, že tato alela není s touto nemocí asociována. Alela HLA-B27 z patogeneze této nemoci může být vyloučena, ovšem k úplnému pochopení toho, jak je tato nemoc spouštěna bude zapotřebí ještě mnoho dalších výzkumů.


  1. SOUHRN

Alela HLA-B27 je součástí Hlavního histokompatibilitního komplexu, který zodpovídá za imunitní odpověď organismu. Tato alela je známá zejména svou asociací s různými autoimunitními revmatickými onemocněními a nejvíce je zastoupena u ankylozující spondylitidy (AS). K dalším degenerativním onemocněním, které postihují páteř, patří vedle AS také vyhřeznutí meziobratlové ploténky. V různých studiích bylo prokázáno, že je toto onemocnění ovlivněno nejen těžkou prací, ale také imunologicky. Našim cílem tedy bylo prokázat, že alela HLA-B27, která je spojena ve velké míře s různými autoimunitními chorobami, ovlivňuje i vyhřeznutí meziobratlové ploténky.

Soubor osob tvořilo 140 pacientů mužského pohlaví, u kterých bylo potvrzeno vyhřeznutí meziobratlové ploténky a 86 kontrolních pacientů mužského pohlaví, kteří se léčili kvůli jiným onemocněním. Ze 140 pacientů bylo pozitivních na alelu HLA-B27 25 osob a z kontrolních pacientů 11 osob. Výsledky byly vyhodnoceny dvoustranným Fisher exact testem, který vyloučil vztah alely HLA-B27 k výhřezu meziobratlové ploténky.
SUMMARY

Allele HLA-B27 is part of a Major histocompatibility complex, that is responsible for the immune response of an organism. The allele is known especially for its association with various autoimmune rheumatic diseases and mostly it is represented mainly in ankylosing spondylitis (AS). Between other degenerative diseases that affect spine, also belongs, as well as AS, the intervertebral disc prolapse. Various studies have shown that the disease is caused not only by hard work, but also by immunity system. Our aim was therefore to prove the relationship between intervertebral disc prolapse and HLA-B27 allele, that is largely associated with various autoimmune diseases.

Testing group comprised of 140 male patients with confirmed intervertebral disc prolapse and 86 male control patients that were treated for other diseases. 25 patients and 11 controls were positive for HLA-B27 allele. Results were evaluated by bilateral Fisher exact test. Test negated HLA-B27 relation with the intervertebral disc prolapse.

Seznam literatury


1. Braun, J., Sieper, J. Ankylosing spondylitis. Lancet. 2007, 369, stránky 1379-1390.

2. Feldtkeller, E., Lemmel, E., Russell, A.S. Ankylosing spondylitis in the pharaohs of ancient Egypt. Rheumatol Int. 2002, 23, stránky 1 - 5.

3. Pavelka, K., Rovenský, J. Klinická revmatologie. Praha 10: nakl.TRINITRON, 2003. stránky 71-80. 3.

4. Olejárová, M. Revmatologie v kostce. Praha 10: nakl.TRINITRON, 2009. stránky 71 - 80.

5. Jaakkola, E., et.al. Finnish HLA studies confirm the increased risk conferred by HLA-B27 homozygosity in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 2006, 65, stránky 775 - 780.

6. Krejsek, J., Kopecký, O. Klinická imunologie. Hradec Králové: nakl.NUCLEUS HK, 2004. stránky 123-152.

7. Hořejší, V., Bartůňková, J. Základy imunologie. 4.vydání. Praha : nakl.TRINITRON, 2009. stránky 72-80.

8. Ferenčík, M., et.al. Imunitní systém. místo neznámé: nakl.Grada Publishing, 2005. stránky 42-46.

9. Meyers, Robert.A. Immunology:from cell biology to desease. Weinheim: nakl.Wiley-VCH, 2007. stránky 54-60.

10. Stites, Daniel.P. Základní a klinická imunologie. Praha : nakl.Victoria Publishing, 1994. stránky 49-51.

11. http://mp.bmj.com/content/56/1/1.full. [Online]

12. López-Larrea, C., Gonzáles, S., Martinez-Borra, J. The role of HLA-B27 polymorphism and molecular mimicry in spondylarthropathy. Molecular medicine today. 1998, stránky 540-549.

13. Mathieu, A., et.al. The interplay between the geographic distribution of HLA-B27 alleles and their role in infectious and autoimmune diseases: A unifying hypothesis. Autoimmunity Reviews. 2009, 8, stránky 420-425.

14. Olejárová, M. Revmatologie v kostce. Praha 10 : nakl.TRINITRON, 2008. stránky 71-80.

15. Ball, E.J., Khan, M.A. HLA-B27 polymorphism. Joint Bone Spine. 2001, 68, stránky 378-382.

16. Khan, M.A., et.al. The pathogenetic role of HLA-B27 and its subtypes. Autoimmunity Reviews. 2007, 6, stránky 183-189.

17. Žlnay, D., Žlnay, M., Rovenský, J. Účinok adalimumabu pri ankylozujúcej spondylitíde s totálnou ankylózou chrbtice a pretrvávajúcou aktivitou choroby. [autor knihy] J., et.al. Rovenský. Vybrané kazuistiky v reumatólogii. Bratislava : nakl.SAP, 2009, Sv. 2.díl, stránky 589-594.

18. Forejtová, Š. Diagnostika a léčba spondylartritid. Medicína pro praxi. 2009, 6, stránky 30-33.

19. Brown, M.A. Progress in studies of the genetics of ankylosing spondylitis. Arthritis Research and Therapy. 2009, 11.

20. http://lekarske.slovniky.cz. [Online]

21. http://www.cvicime.cz/cviceni-praha/anatomie/rovne/vadne_drzeni.html#skolioza. [Online]

22. http://www.webmd.com/back-pain/guide/ankylosing-spondylitis. [Online]

23. http://indiahealthtour.com/treatments/spine-surgery/ankylosing-spondyliti-treatment.html. [Online]

24. http://old.lf3.cuni.cz/studium/materialy/revmatologie/sers.html. [Online]

25. http://www.radswiki.net/main/index.php?title=Ankylosing_spondylitis. [Online]

26. Bošák, V.,. HLA-systém a reumatické choroby. Výzkumný ústav reumatických chorob. Piešťany : autor neznámý, 1999. stránky 27-35.

27. Oegema, T.R. Intervertebral disc herniation: Does the new player up the ante? Arthritis and Rheumatism. 2010, 62, stránky 1840-1841.

28. Mlčoch, Z.,. VERTEBROGENNÍ ALGICKÝ SYNDROM. Med. Pro Praxi. 2008, 5(11), stránky 437–439.
Yüklə 149,25 Kb.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə