Mikroskop ansiklopedisi Doç. Dr. Sait ŞEN; Ege Üniversitesi Tıp Fak. Patoloji ad
Yüklə 65,55 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Karanlık alan kondansörü
- Mikroskopta aydınlatma yöntemleri
- Patolojide özel mikroskobi uygulamaları
- Transmisyon elektron mikroskop;
- +100 keV (40 to 400 keV)
- High Resolution TEM HRTEM)
| 50 Mikroskop ansiklopedisi Doç. Dr. Sait ŞEN; Ege Üniversitesi Tıp Fak. Patoloji AD. Patoloji pratiğinde basit öğrenci mikroskoplarından başlayıp, her türlü uygulamayı yapabilecek araştırma mikroskoplarına kadar uzanan eski veya yeni, oldukça geniş bir mikroskop jenerasyonu bulunmaktadır. Burada rutin patoloji laboratuvarında bulunabilecek özelliklerdeki bir araştırma mikroskopu üzerinde mikroskopa ait temel yapılar ve mikrofotografik uygulama özellikleri ile gelişmiş önemli mikroskoplar ve uygulamalar özetlenecektir. Genel olarak mikroskop, mekanik ve optik bölüm olmak üzere iki ana bölüm içermektedir. Mekanik bölüm Mikroskopta ana gövdeyi oluşturan ve optik bölüm elemanlarını taşıyan kısımdır. Bu bölümde gövde, mikroskop ayağı, obje tablası, şaryo, makro ve mikro vida düzeneği yer almaktadır. Araştırma mikroskoplarının çoğunluğunda bazı şekil değişiklikleriyle bu yapı korunmaktadır. Gövde;
mikroskopun bütün mekanik ve optik elemanlarını taşıyacak sağlamlık ve biçimdedir, gereğinde mikroskoba eklenebilecek mikrofotografi veya diğer aygıtları taşıyabilir. Mikroskop ayağı: Gövde ile birlikte diğer mikroskop bölümlerini üzerinde taşıyan kısımdır. Modern mikroskoplarda ışık kaynağı ve bundan gelecek ışınların kondansöre iletilmesini sağlayacak optik elemanları içine alabilecek biçimde bir yapı kazanmıştır ve gövde ile birlikte değerlendirilebilir. Obje tablası: Mikroskopik preparatların kalaylıkla yerleştirilmesi ve izlenebilmesi için genelde geniş ve dikdörtgen biçimde yapılmaktadır. Tek veya iki preparat alabilir. Tabla içine gömülü şaryo sistemi, preparatın objektif önünde son derece duyarlı bir şekilde sağa-sola ve aşağı-yukarı hareketini sağlar. Şaryo hareket vidalarıda elin kolayca ulaşabileceği bir biçimde sağa veya sola yerleştirilebilir. Modern motorize mikroskoplarda şaryo elektronik kontrollü ve motorize olabilir, bilgisayar tarafından kontrol edilebilir. Makro ve mikro (kaba-ince ayar) vida düzenekleri; Preparatta gözlenen mikroskopik alanın netliğini sağlamak üzere, obje tabasına kaba (makro) ve ince (mikro) hareket yaptıran bir vida düzeneğini oluşturmaktadır. Gelişmiş araştırma mikroskobu ve fotografi mikroskoplarında ayarlar elektronik kontrollü motorize olabilir ve fokus yapılabilir.
51 Optik bölüm Mikroskopun optik bölümünde; oküler, oküler tüpleri, objektif, kondansör ve ışık kaynağı yer almaktadır. Oküler;
Optik sistemdeki görevi, objektif ile koordine çalışır ve objektif tarafından oluşturulan ara görüntüyü kendi büyültme oranı kadar büyülterek göze ulaştırmaktır. Oküler üzerindeki büyültme gücünü (X6.3, 10, 15, 20, 30), görüş çapını belirleyen rakamlar (18, 20, 22, 26.5) ile bazı tanımlayıcı harfler (UW, SWF) bulunur. UW veya UWF, “Ultra Wide - Ultra Wide-Field” ultra geniş alan benzer şekilde WF “Wide-Field” genil alan, SW yada SWF “Super Wide-Field” super geniş alanı gösterir. H, HE yada “High Eyepoint” okülerin gözlükle kullanılabileceğini gösterir. CF CF düzeltmeli objektiflerle kullanılabileceğini gösterir. Genel olarak okülerlerden birinde diyoptri ayarı yapmaya olanak sağlayan bir mekanizmada eşlik eder. Okülerlerden gözün uzaklığını belirleyen ve oda ışığının yansımasını engelleyecek bir lastik çerçevede bulunur. Mikroskopta kullanılacak oküler, kullanılan objektifin türüne uyacak şekilde seçilmelidir. Mikroskopik incelemelerde Apokromat ve Plan objektiflerle birlikte mutlaka Plan-Kompens (PK) tipi okülerler kullanmak gereklidir. Aksi halde görüntünün renk ve görüntü kusurları tam olarak düzeltilemez. Tüp: Tüp klasik olarak monooküler eski mikroskoplarda belirlenebilir, okülerin devamını oluşturur içinde sanal imaj oluşur. Modern mikroskopların çoğunda, iki gözle bakmaya olanak verecek şekilde “binoküler” özellikte, bazılarında fotoğraf kamerası eklenebilmek üzere bir fotoğraf tüpü “trinoküler”, tüp sistemine eklenir bu yapıya dahil edilerek sonlanmaktadır. Trinoküler sistemlerde fotoğraf bölümüne görüntü iletimi prizmalar ile kontrol edilerek devreye alınmakta ve/veya farklı oranlarda ışık dağıtılabilmektedir. Eğitim ataşmanları eklenecekse bu arada sisteme uygun şekilde eklenir ve görüntü dağıtımı yapılabilir. Bir mikroskopta yan görüntü dağıtımları ile gözlemci sayısı 21 kişiye kadar yükselebilir. Bu sırada işaretleme için ok sistemide devreye girmektedir. 52 Objektif: Mikroskopun optik bölümü içerisinde en önemli kısımdır. Mikroskopik objeyi büyültme gücü oranında büyülterek ara görüntüyü oluşturur, tüp yoluyla okülere görüntü iletilir. Bir mikroskopun büyütme gücü, objektifin büyültme gücü ile okülerin büyültme gücü çarpımı kadardır. Mikroskoplarda görüntü kalitesi üzerinde birinci etken objektifin optik yapısıdır. Mikroskoplarda kullanılan objektifleri optik yapısı bakımından; a) Akromat, b) Apokromat, c) Plan apokromat d) flörit objektiler olarak ayırdedebiliriz. Akromat objektifler: Genelde basit öğrenci mikroskopları ve rutinde kullanılan bazı mikroskoplarda akromat objektifler bulunmaktadır. Bunlar, görüntü kusuru yönünden düzeltilmemiş, renk kusuru yönünden de yalnızca sarı-yeşil renge göre çok iyi düzeltilmiş objektif grubunu oluştururlar. Plan objektifler: Karakteristik bir mercek kusuru olarak görüntü alanının bükülmesi lenslerde ortaya çıkmaktadır. Yani merkez netleştirildiğinde kenarları net olmamakta, aksine kenarları net yapıldığı zamanda da merkez net olmamaktadır. Bu görüntü kusuru, özel optik yapı değişiklikleriyle ortadan kaldırılarak Plan objektif serisi oluşturulmuştur. Plan objektifler renksel kusurlarının düzeltilmesi durumuna göre, Planakromat, Planfluorit ve Planapokromat yapısında olabilirler. Fluorit sistem: Bu objektif tipi renksel kusurları çok iyi düzeltmeyi sağlayan bir optik yapı içermektedir. Son yıllarda bu objektifler çok iyi geliştirilmiş, özellikle mikrofotografide ve Fluoresan mikroskopide yaygın olarak kullanılmışlardır. Objektiflerin adlandırılmalarıda üzerlerine yazılan kısaltmalarla yapılmaktadır. Fluorit objektifler “FL”, Apokromat objektifler “Apo”, Plan objektiflerde “Plan” veya “Pl” kısaltmalarıyla gösterilirler. Bunlardan başka her objektifin üzerinde, objektifin büyültme gücü, apertür açıklığı, tübus uzunluğu ve lamel kullanımına ilişkin rakamlar, renkler yer almaktadır.
53 Kondansör; Optik sistemde ışık kaynağından gelen ışığı preparat üzerine homojen olarak dağıtan, yapısına göre değişik aydınlatma yöntemlerinin uygulanmasına olanak veren bir optik sistemdir. Optik özelliklerine göre : a) Basit kondansörler, b) Aplanatik kondansörler, c) Aplanatik-Akromatik kondansörler, d) Faz kontrast kondansörleri, e) Karanlık alan kondansörleri olarak ayrılırlar. Basit kondansörler: çoğunlukla iki
mercekli olup
renk kusurları yönünden düzeltilmemişlerdir. Daha çok basit öğrenci mikroskoplarında kullanılırlar. Aplanatik kondansörler: Mercek yapısı nedeniyle daha iyi kalitede bir aydınlatma sağlarlar. Renksel kusurları orta derecede düzeltilmiştir. Aplanatik-Akromatik kondansörler: Optik aydınlatma yönünden çok iyi gelişmiş mercek sistemi ile renk kusurları yönünden tamamen düzeltilmişlerdir. Faz kontrast kondansörleri: Optik yapısı bakımandan Aplanatik-Akromatik yapıdadır. Ayrıca kondansörün içine her objektif için ayrı ayrı, bir eksen etrafında dönecek biçimde 54 düzenlenmiş faz halkaları yerleştirilmiştir. Faz kontrast kondansörü ile beraber mikroskopa özel faz kontrast objektifleri takılarak faz kontrast çalışma yapılabilmektedir. Faz kontrast objektifleri içinde de her objektife özgü ayrı ayrı faz halkaları vardır. Hangi büyütmeli objektif kullanılıyorsa kondansörde o objektife uygun faz halkası optik eksene getirilir. Faz kontrast çalışmanın temeli, boyanmamış preparatlarda objede bulunan yoğunluk farklarını faz farklarına dönüştürerek objenin değişik bölgelerini farkla yoğunluklarda göstermeye dayanmaktadır. Bu yöntemle özellikle canlı doku ve hücre örnekleri zarar görmeden hücre ayrıntıları yönünden çok daha iyi incelenebilmektedir.
ışık, kondansör içindeki belirli yüzeylerden yansıyarak objeye belli bir açıda ışığın girmesine neden olur. Bu sistemde objedeki yapılardan yansımayan hiç bir ışık objektif görüş alanına giremez. Karanlık alan kondasörleri kuru ve yağlı olmak üzere iki tiptir. Kuru tipte kondasör ile preparat arasında ışık iletici herhangi bir ortama gerek yoktur. Yağlı karanlık alan kondansöründe ise, kondansör üst merceği ve preparatın alt yüzü arasında ışık iletimi için immersiyon yağı veya gliserin kullanılmaktadır. Işık kaynağı: Gerek mikroskopik aydınlatma gerekse mikrofotografide oldukça önemli bir bölümü oluşturmaktadır. Bugünkü modern mikroskoplarda aydınlatmada ışık kaynağı olarak çoğunlukla düşük voltajlı yüksek ışık güçlü halojen lambalar kullanılmaktadır. Normal mikroskopik aydınlatmada kullanılan 6 Volt 20-30 Watt lambalar, araştırma mikroskoplarında yerini 12 Volt 100 Watt Halojen lamabalara bırakır. Mikroskopik aydınlatmada bu lambalar görünür ışık dalga bandındaki çalışmalarda kullanılmaktadır. Işık mikroskobik aydınlatmada led ampüllerde kullanıma girmiştir. Gövde üzerinde ışık şiddetini ayarlayan reosta ve açma kapama düğmesi yer alır. Ultraviole dalga boyunda ışınların kullanıldığı fluoresan mikroskopide ise, güçlü ışın veren civa buharlı yüksek basınç altında hazırlanmış değişik güçlerde özel lambalar kullanılmaktadır. Bunlar, üreten firmanın kendine özgü kısaltılmış simge ve rakamlarıyla belirtilmektedir. Bunlara HBO 50, HBO 100, gibi lambalar örnek verilebilir. Flöresan incelemede kullanılan ışığın dalga boyları 313, 334, 365, 406, 435, 546 ve 578nm dir ve özel filtreler bu amaca uygun olarak seçilir. Yeni uygulama olarak flöresan aydınlatmada spesifik dalga boylu led ampüllerde kullanılmaya başlanmıştır. Zeiss in Colibri sisteminde aynı anda birden fazla led ışık ile farklı dalga boylarında aydınlatma ile çalışmak olasıdır. halojen lamba civa arklı lamba ksenon arklı lamba Ksenon lambalar oldukça parlak ışığa ihtiyaç duyulan yansıtmalı “reflekted” mikroskobide tercih edilir. Halojen lambadan parlak iken civalı lambaların yoğunluk pikine ulaşamamakla flöresan mikroskobide kullanılabilir. 55 Mikroskopta aydınlatma yöntemleri: Değişik bilim dallarında kullanılan mikroskoplarda, mikroskopta incelenen objenin özelliğine göre, özel aydınlatmalar sağlayacak yapısal değişiklikler görülmektedir. Biyoloji ve tıbbın değişik alanlarında kullanılan mikroskoplarda genel olarak alttan (içten – geçirgen – transmitted) ve üstten (yansıtmalı- reflected) aydınlatma yapabilecek bir optik yapı bulunmaktadır. geçirgen görüntüleme yansıtmalı görüntüleme Bir araştırma mikroskobunda aynı anda hem görünür ışık dalga boyunda alttan aydınlatma ve flöresan ışıkla üstten aydınlatma yapılabilmektedir. Biyolojinin bazı alanlarında, örneğin botanik, zooloji ve paleobotanikte, objelerin dış yüzeyini incelemek üzere üstten aydınlatmada kullanılabilecek ışık yansıtmalı (reflected-light) objektifler geliştirilmiştir. Bunlarda objeyi aydınlatacak ışık, tübus ve objektif içindeki özel ayna yüzeylerden yansıtılarak obje yüzeyine ulaşmakta, aydınlatılmış obje yüzeyinden elde edilen görüntüde ortadaki objektif tarafından okülere iletilmektedir. Üstten aydınlatmada bir diğer aydınlatma tipi, özellikle ışık geçirmeyen objelerin incelenmesinde metalurji ve mineraloji bilim dallarında kullanılmaktadır. Bu dallarda kullanılan mikroskoplarda üstten aydınlatmada ışık yolu resim’de gösterilmiştir. Burada, objektif-oküler eksenine eklenen bir yarı geçirgen prizma ile preparatın aydınlatılması ve preparattan gelen görüntünün incelenmesi doğrudan doğruya objektif içerisinden yapılmaktadır. Patolojide özel mikroskobi uygulamaları Patoloji uygulamaları genelde parlak-aydınlık saha ve geçirgen ışıkla, ve farklı boyama yöntemleri ile yapılmaktadır. Bir çok uygulamada doku bütünlüğü bozulmadan ve boyama yapılmadan değerlendirme de gerekebilmektedir. Bu durumlarda özel mikroskobi uygulamaları yapılamaktadır. Bunlara örnek olarak ışığın üsten uygulandığı reflected mikroskobi ve/veya karanlık saha uygulamalar ile ultraviyole ışıklarla görüntüleme örnek verilebilir. Flöresan mikroskobi Civa veya ksenon arklı güçlü ışık kaynakları ile mümkün olur. Özel filtreler yardımı ile belli dalga boyunda aydınlatılan doğal yada yapay olarak boyanmış flöresan ışık veren maddeler incelenir. Siyah zeminde flöresan veren yapılar değerlendirilir.
56 Genelde reflected- yansıtmalı teknik kullanılır. Civa arklı lambanın belli bir dalga boyundaki ışığı araştırılan doku üzerine yönlendirilir. Bu ışıkta renk veren otoflöresan veya boyalı maddeler siyah zeminde flöresans verir. Burada basit olarak FITC ile işaretli monoklonal antikorlar kullanılabileceği gibi digital fotografi yardımıyla üstü üste bindirilen fotograflarla farklı filtre setleri kullanılarak çoklu flöresan boyama (FİSH) yapılabilir. Özel flörid objektifler kullanılması daha uygundur. Flöresan mikroskobide dalga boyları. FITC boyamada, mavi olarak gelen UV ışık, yeşil refle olarak okülerden göze yansır. Karanlık saha mikroskobisi Özel kondansör ve objektiflere ihtiyaç duyar, ışık alttan veya reflected olarak üstten uygulanabilir. Reflekted karanlık sahada objektifler LWD (Long Working Distance), uzun çalışma mesafesi ULWD ve ELWD (Ultra-Long Working Distance), (Extra-Long Working Distance) olarak belirlenir.
57 Polarizasyon mikroskobi Rutin parlak saha ışık mikroskobisindeki polarizasyon mikroskobunda polarizör ve analizör olmak üzere iki filtre bulunur ve ışık patikasına yerleştirilir. Polarizör tablanın altında ışık kaynağının üstünde bulunur, 360 derece döndürülme imkanı vardır, soldan sağa veya doğu batı yönünde vibrasyona izin verir. Analizör ise genellikle kuzey güney yönde düzenlenmiştir ve objektifin üzerinde bulunur. Bazı sistemlerde analizörde döndürülebilir. Kullanılmadığında ışık patikasından çıkarılabilir. Özellikle amiloid birikimlerinin Kongo kırmızısı boyamasında elma yeşili refle vermesinde önem taşır. Ayrıca dokudaki kristaller polarizasyon ile çok kolay tanınabilir. Işık mikroskobu için polarizör ve analizörden oluşan polizasyon filtreleri ile basit ara parça
Günümüzde mikrofotografi sistemleri, değişik üreticilerin üretmiş oldukları mikroskoplara eklenebilen, basitten yüksek çözünürlük ve hıza kadar değişen özelliklerde digital makinalardan oluşmaktadır. Bazıları görüntüyü üzerindeki belleğe aktaran digital fotograf makinaları iken, bazıları yanında kontrol ve depolama için bilgisayara ihtiyaç duyan kameralardan oluşur. Digital fotografinin gelişimi ile fotograf çekmek çok kolaylaşmıştır. Bu makinalarda klasik fotografide karşımıza çıkan film seçimi, pozlandırma süre ve ayarları tam otomatik olarak yapılmaktadır. Kullanılan makinalar günlük hayatta kullanılan digital fotograf makinaların mikroskoba uyarlanan şekilleri olabilir. Bu durumda özel ara adaptörler ve özel mikroskop ayarları gerekecektir. Ancak son zamanlarda özel digital kameralar, ara ekipmanlar (depolama ve görüntüleme için) yada bilgisayar kullanımı daha ön plandadır. Bu sistemlerden doğrudan barkovizyon veya televizyon gibi cihazlara direkt aktarım da mümkün olabilmektedir. Bu görüntüler telekonferans ve konsultasyon için kullanılabilir. Bazı özel yazılım ve mikroskoplar ile konferansa katılanlar ve değerlendiriciler mikroskoba uzaktan kumanda edebilirler. Sanal mikroskobi Özel yapılmış mikroskoplar ve kamera sistemleri ile preparatlar taranır ve bilgisayar ortamına aktarılır. Depolanan görüntü özel programlarla bilgisayar ekranı üzerinde, mikroskopta olduğu gibi dolaşıp, büyütülerek incelenir. Kongrelerde ve bazı dergilerdeki olgu sunumları, konsultasyonlar ve çok merkezli çalışmalar bu şekilde yapılabilmektedir. Gelecekte öğrenci, asistanların eğitim arşivlerinin bu şekilde oluşturulması ve internet ile eğitim, sınavların 58 bilgisayar üzerinden gerçekleştirilmesi olası olacaktır. Daha ütopik olarak laboratuvar dışından preparatlarımıza ulaşma ve tanı koyma imkanına sahip olabileceğiz. Bu araçlar mikroskop üreticilerin kendi ortaklıkları veya geliştirdikleri sistemler (Nikon- aperio, Olimpus-dotslide) ile yürümektedir. Mikroskop firmaları kendilerini bu şekilde geleceğe hazırlamakta, mikroskopa alternatif olarak sunmaktadır. Bu konudaki örnek uygulamalar http://www.patoloji.med.ege.edu.tr/nepathol/sanal%20mikroskobi.html internet adresinde gösterilmiştir. Dokuz Eylül Üniversitesi öğrenci eğitiminde kendi sistemini kullanmaktadır. http://194.27.56.209/mirax/ . Burada bir preparatın görüntüsü, doku boyutu yanısıra tarama çözünürlüğü, ve sistemne göre değişmekte olup 40 GB’a ulaşabilmektedir. Tarama süresi ise 2 dakikalara kadar inmiştir.
Elektron mikroskop örneğin elektronik olarak büyütülmüş görüntüsünü oluşturan bir mikroskop tipidir. Örneği görüntülemek için elektron partiküllerini kullanır ve büyütülmüş görüntü oluşturur. Optik ışık mikroskobuna göre görülebilir (foton) dalga boyu 100,000 kez küçük olduğundan 1,000,000 kat büyük görüntü oluşturabilir, optik mikroskobun büyütmesi ise 2,000 kat ile sınırlıdır. Görüntü oluştururken, elektron akımını kontrol etmek ve odaklamak için elektrostatik ve elektromagnetik “lens”ler kullanır. Optik mikroskop kalitesinde olan ilk elektron mikroskop 1933 te Ernst Ruska tarafından oluşturuldu. Patent ise 1931 yılında Siemens tarafından alınmıştı, Rutka 1937 yılında Siemens ile çalışmaya başladı, 1939 da ilk ticari geçirgen elektron mikroskop (Transmission Electron Microscope (TEM)) ortaya çıktı
kullanılır, Elektron tabancası elektronları yayar, elktron kaynağı tungsten Flamanlı bir katoddur. Elektron ışınları +100 keV (40 to 400 keV) anod ile hızlandırılır, elktrostatik ve elektromagnetik lensler ile odaklanır ve incelenecek örneğin içinden geçer. Dışarı çıkan ışınlar mikroskopun objektif lens sistemiyle büyütülür ve bu bilgi flöresan görüntüleme ekranına aktarılır. Görüntü olarak değişik ortamlarda depolanır. CCD kamera ile yakalanan görüntüler bilgisayar veya monitorlerde görüntülenebilir. TEM görüntülerde de sferik aberrayonlar sınırlayıcıdır, yeni jenerasyon düzelticiler ile bu düzeltilip rezolüsyon artırılmıştır. Yüksek rezolüsyonlu TEM’lerde (High Resolution TEM HRTEM) rezolüsyon 0,5 Angstrom (50 picometre) altına inmiştir (50 milyon büyütme). Taramalı elektron nikroskop (Scanning electron microscope (SEM)) TEM’den farklı olarak SEM’in elektron ışınları örneğin tam görüntü bilgisini içermez. Örnek dört tarfından elektron ışınları ile taranır ve örneğin her köşesinde elektron demetleri enerji kaybeder ve kayıp enerji ısı, ışık, elektronlara sekonder düşük enerji, veya x ışınına çevrilir. Örnekte enerjinin oluştuğu bölüme göre bu sinyallerin yoğunluğunun görüntüsü SEM görüntüsünü oluşturur. Genel olarak SEM imaj kalitesi TEM’e göre düşüktür. SEM görüntüsü örneğin yüzeyini gösterir.
1. http://www.zeiss.de/C1256B5E0047FF3F/?Open 2. http://www.microscopy.olympus.eu/microscopes/About_Microscopy_7436.htm 3. http://olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.html 4. http://194.27.56.209/mirax/ 5. http://www.patoloji.med.ege.edu.tr/nepathol/sanal%20mikroskobi.html 6. http://www.path.uiowa.edu/virtualslidebox/ Yüklə 65,55 Kb. Dostları ilə paylaş:
|