Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının Sitozol və Mitoxondri Fraksiyalarında nad-malatdehidrogenaza Fermentinin Müqayisəli
Yüklə 133,09 Kb. Pdf görüntüsü
|
| AMEA-nın Xəbərləri (biologiya və tibb elmləri), cild 70, №3, səh. 39-47 (2015)
39 Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının Sitozol və Mitoxondri Fraksiyalarında NAD-Malatdehidrogenaza Fermentinin Müqayisəli Öyrənilməsi H.Q. Babayev AMEA Molekulyar Biologiya və Biotexnologiya İnstitutu, Mətbuat prospekti, 2A, Bakı AZ 1073, Azərbaycan; E-mail: babayev_hg@yahoo.co.uk Amarant yarpaqlarının mezofil (MH) və örtük topa hüceyrələrinin (ÖTH) sitozol və mitoxondri fraksiyalarında bitkinin inkişafının çiçəkləmə (Ç) və toxum yetişmə (TY) fazalarında quraqlığın təsirindən NAD-malatdehidrogenaza (l-malate-NAD-oksidoreduktaza, NAD-MDH, EC 1.1.1.37) fermentinin lokalizasiyası, izoferment spektri, fiziki-kimyəvi və kinetik xassələri tədqiq olunmuşdur. Müəyyən olunmuşdur ki, amarant yarpaqlarında bitkinin inkişaf fazasından asılı olaraq NAD-MDH geniş izoferment spektrinə malikdir və quraqlığın təsirindən fermentin izoformalarının sayında, fəallığında və xassələrində əhəmiyyətli dəyişkənliklər baş verir. MDH-nin sitozol NAD-MDH-nın (sNAD-MDH) kataliz etdiyi reaksiyanın V max OA qiyməti mitoxondri NAD-MDH-sına (mNAD-MDH) nisbətən 2 dəfə çoxdur. Fermentin bütün izoformaları geniş pH optimuma malikdirlər və temperatura qarşı davamlılıq göstərirlər. Ferment subhüceyrə fraksiyasından asılı olaraq öz substratı olan oksalasetata (OA) qarşı yüksək, malata qarşı isə aşağı həssaslığa malikdir. NAD-MDH-nın kataliz etdiyi reaksiya, ümumilikdə, Mixaelis-Menten qanunauyğunluğuna tabe olub, heç bir allosteriklik göstərmir. Fermentin aktivliyi aralıq substratlar, bir və iki valentli ionlarla ciddi tənzim olunur.
lokalizasiya, quraqlıq, adaptasiya GİRİŞ
Quraqlıq stresinin təsirindən bitkilərdə suyun nisbi miqdarı, su potensialı, hüceyrənin turqor təz- yiqi aşağı düşür, qeyri-üzvü ionların və həll olan maddələrin miqdarı artır, məhsuldarlıq isə azalır (Fedoroff et al., 2010). Quraqlıq stresi nəticəsində bitkinin inkişafının ləngiməsinin,başqa səbəblərlə yanaşı, qismən karbon statusundakı dəyişikliklərlə bağlı olması ilə yanaşı, həm də fotosintetik assimil- yatların müxtəlif orqanlar arasında paylanmasından, həmçinin fotosintez və tənəffüs arasındakı tarazlıq- dan da asılıdır (Flexas et al., 2006). Bəzi tədqiqat- çılar göstərirlər ki, stres amillərinin təsirindən foto- sintezin inhibirləşməsinin səbəblərindən biri də CO 2
tronların qeyri-tsiklik daşınması arasındakı funksio- nal əlaqənin pozulmasıdır (Murata et al., 2007). Aparılan tədqiqatlar zamanı müəyyən olunmuşdur ki, orqanizmlərin mühitin dəyişən şəraitinə cavab reaksiyası hüceyrənin konstruktiv və energetik mü- badiləsində mühüm rol oynayan malatdehidrogena- za (MDH) sistemi fermentlərinin labilliyi ilə də bağlı ola bilər(Сатар и др., 2010). Bitki MDH sistemi fermentləri özünü orqa- nizmlərin tələbatına və fizioloji vəziyyətinə, həmçi- nin ətraf mühitin dəyişməsinə cavab vermək imkan- larına malik olan zülalların dinamik tarazlığı kimi təqdim edir (Пинейру де Карвалью и др., 1991). Bitki toxumaları malatla OA-ın qarşılıqlı çev- rilməsini kataliz edən NAD-MDH-nın çoxsaylı izo- formalarına malikdirlər (Пинейру де Карвалью и др., 1991). Bitkilərdə müxtəlif genlərlə kodlaşan bu izoformalar fərqli kinetik xassələrə, subhüceyrə paylanmasına və fizioloji funksiyalara malikdirlər (Gietl, 1992). МDH fermentlərinə arxeobakteriyalardan tut- muş məməlilərə qədər bütün canlı orqanizimlərdə və bütün subhüceyrə orqanoidlərində (mitoxondri- lərdə, qlioksisomlarda, peroksisomlarda, хloroplast- larda və s.) rast gəlmək olur (Selinski et al., 2014). Bütün MDH-lar iki və ya dörd identik sub- vahidlərdən ibarət multimer fermentlərdir (Yash- vant et al., 2013). mNAD-MDH-nın bitkilərdə bir neçə istiqamətdə fəaliyyət göstərdiyi güman edilir. O, klassik Krebs tsiklinın son reaksiyasının məh- sulu olan malatı OA-a qədər oksidləşdirir (Nunes- Nesi et al., 2007). mNAD-MDH yalnız Krebs döv- ranında NADH-ın oksidləşməsi üçün deyil, həm- çinin müxtəlif hüceyrə kompartmentlərindəki meta- bolik yollar arasında reduksiyaedici ekvivalentlərin mübadiləsində də iştirak edir (Tomaz et al., 2010). Bəzi müəlliflər MDH subvahidlərinin yalnız tə- nəffüs ilə deyil (Tomaz et al., 2010), fototənəffüs, yağ turşularının β-oksidləşməsi, toxumun cücərmə- si və stresə davamlılıq kimi proseslərlə də əlaqəli olduğunu göstərirlər (Wang et al., 2014).
Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 40
Beləliklə, NAD-MDH-nın mühüm bir funksi- yanı yerinə yetirməsi onun ali bitkilərdə karbonun və enerjinin paylanmasında vacibliyini göstərir və tənəffüs, fotosintez və fototənəffüsü əlaqələndirən molekulyar mexanizmlər haqqında yeni ideyalar verir (Tomaz et al. 2010). C 4
və morfo-fizioloji quruluşa malik olması onlara C 3 - bitkilərlə müqayisədə daha çox adaptiv xassə verir (Бальнокин и др., 2005). Stres vəziyyətinə düşmüş bitkilərdə stresə qarşı adaptasiyanın yaranmasının biokimyəvi və molekulyar mexanizmlərinin öyrə- nilməsi hələlik tam olaraq öz həllini tapmamışdır. Burada maraqlı amillərdən biri də MDH sistemi fermentlərinin labilliyi, mürəkkəb izoenzim spektri- nə malik olması və polifunksionallığıdır. Bütün bunları nəzərə alaraq apardığımız tədqi- qatların əsas məqsədi-quraqlığın təsirindən NAD- malik enzim tip C 4 -bitki olan amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-ninsitozol fraksiyasında NAD-MDH- nınaktivliyinin, izoenzim spektrinin, lokalizasiya- sının, bəzi fiziki-kimyəvi və kinetik xassələrinin öyrənilməsindən ibarətdir.
Tədqiqat obyekti olaraqtəbii şəraitdə becəril- miş NAD-malik enzim tip C 4 -bitkisi olan amarantın Amaranthus cruentus L. növü götürülmüşdür. İnki- şafın 30-cu günündən başlayaraq quraqlıq varian- tında suvarılma dayandırılaraq süni torpaq quraqlığı yaradılmış, kontrol bitkilərdə isə suvarılma vegeta- siyanın sonunadək davam etdirilmişdir. Amarant yarpaqlarınin assimilyasiyaedici toxumalarının ay- rılması bizim tərəfimizdən modifikasiya olunmuş üsulla həyata keçirilmişdir(Guliyev et al., 2003). Ferment preparatının alınması: Ferment preparatı almaq üçün yarpaqlar gövdədən ayrılmış, distillə suyu ilə yuyulduqdan, filtr kağızı ilə quru- dulduqdan sonra qayçı ilə xırda hissələrə doğranmış və həvəngdə kvars qumunun iştirakı ilə 2 dəqiqə müddətində 20 мМ MgCl 2 ·6H
2 O, 1 мМ ЕДТА, 5 мМ ДТТ və 0,5% PVP-25 tərkibli, 100 mМ,pH 8,0 Тris-HCl bufer məhlulunda +4ºC temperaturda ho- mogenizasiya olunmuşdur (1:5, M/V). Subhüceyrə fraksiyalarının və membran zülallarının ayrılması üçün homogenizasiya buferinə 1%-li Triton X-100 əlavə olunmuşdur. Alınan homogenat ikiqat kap- rondan süzüldükdən sonra nüvədən və parçalanma- yan toxuma qalıqlarından azad olmaq üçün əvvəlcə 5 dəq 1000 g, sonra isə 15 dəq 10000 g sürəti ilə sentrifuqalaşdırılmışdır. Çöküntü atıldıqdan sonra supernatant fermentin aktivliyini təyin etmək üçün istifadə edilmişdir. NAD-MDH aktivliyinin təyini: NAD-MDH aktivliyi spektrofotometrik (Ultrospec 3300 pro, Amersham, USA) üsulla təyin olunmuşdur (Schei- be, Stitt, 1988). OA-nın reduksiyasının reaksiya mühiti 1 mM OA, 10 mg/ml BSA, 10 mM MgCl
2 ·6H
2 O, 0,15 мМ NAD·H və 5-10 µl ferment preparatı olan 100 мМ, pH 8,0, Tris-HCl buferindən ibarətdir. Reaksiya mühitinə 1 mM OA əlavə olunmaqla reaksiyanın başlanmasına start ve- rilmişdir. Birbaşa reaksiyanın mühiti tərkibində 30 mM malat, 0,2 mM NAD olan 100 mM, pH 9, Tris- HCl bufer məhlulundan ibarətdir. Fermentin aktiv- liyi 340 nm dalğa uzunluğunda 1 dəqiqə ərzində spektrofotometrik küvetdə olan NAD·H-ınsərf olunması hesabınaoptiki sıxlığının azalmasına əsa- sən təyin edilmişdir. NADH və NADPH üçün eks- tinksiya əmsalı 340 nm dalğa uzunluğunda 6,22 mМ·sm
-1 götürülmüşdür. NAD-MDH-nın molekul çəkisinin təyini: NAD-MDH-nın və onun subvahidlərinin nisbi mo- lekul kütlələri gel-elektroforez üsulu ilə təyin olunmuşdur (Laemmli, 1970). Elektroforez zamanı β-qalaktozidaza (116 kDa), öküzün zərdab albumini (BSA) (66,2 kDa), yumurta albumini (45 kDa), laktatdehidrogenaza (35 kDa), restriktion endonuc- leaza BSP981 (25 kDa), α-laktoqlobulin (18,4 kDa) və lizosim (14,4 kDa) zülal-markerləri istifadə olunmuşdur. Zülalların miqdari təyini: Zülalların ümumi miqdarı Sedmak, Grossberg üsuluna (1977) əsasən təyin olunmuşdur. Dərəcəli əyrinin qurulması üçün öküzün zərdab albumini (BSA) istifadə edilmişdir. Statistika: Cədvəl və qrafiklərdə verilən qiy- mətlər üçdən az olmayan bioloji və analitik təkrar- ların orta riyazi göstəricilərindən ibarətdir.
NƏTİCƏLƏR VƏ ONLARIN MÜZAKİRƏSİ Alınan nəticələr göstərir ki, amarant yarpaq- larında NAD-MDH bitkinin inkişafının 40-60-cı günlərində optimal aktivliyə malik olur. Fermentin aktivliyi gün ərzində iqlim amillərinin (temperatur, işığın intensivliyi, fotoperiod, rütubət və s.) səviy- yəsi ilə xarakterizə olunan sutkalıq tsikldən də ası- lıdır. NAD-MDH günorta saatlarında (12-15 00 )ən
yüksək aktivliyə malik olmuşdur. Güman etmək olar ki, günorta saatlarında temperatur, işıq və s. amillərin intensivliyinin artması, rütubətin isə azalması ağızcıqların bağlanmasına səbəb olub stres zamanı fotosintezin işini tənzimləyir.
Reaksiya və homogenizasiya mühitlərinin pH-ı da fermentlərin aktivliyinə təsir edən əsas amil- lərdən hesab olunur. Belə ki, amarant yarpaqlarında NAD-MDH pH-ın 7,5-8,0 qiymətlərində optimal aktivlik göstərmişdir. Reaksiya mühiti üçün optimal hesab olunan bu göstərici homogenizasiya mühiti- nin pH göstəricisindən müəyyən qədər fərqlənmək- lə 8,0-8,2 qiymətinə malik olmuşdur.
H.Q. Babayev 41
Məlumdur ki, C 4 -bitkilər C 3 -bitkilərlə müqayi- sədə ekstremal mühit amillərinin təsirinə qarşı daha çox davamlılıq göstərdiklərindən, amarant etalon bitki kimi götürülməklə onun yarpaqlarında NAD- MDH-nın aktivliyi, lokalizasiyası və izoferment tərkibi öyrənilmişdir. Şəkil 1A və cədvəl 1-dən göründüyü kimi, çiçəkləməönü fazada amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin sitozol fraksiyalarında kontrol və quraqlıq variantlarında NAD-MDH aktivliyi quraqlığın baş- lanğıcında bir-birinə yaxın olmuşdur. Amarantın in- kişafının çiçəkləmə və toxumyetişmə fazasında isə bunun əksinə olaraq hər iki variantda fermentin ak- tivliyi çiçəkləməönü fazaya nisbətən artmış və bu artım quraqlıq variantlarda kontrolla müqayisədə daha yüksək olmuşdur. Bu mənzərə növbəti fazalar- da dadavam etmiş və vegetasiyanın sonunda toxum yetişmə mərhələsinə nisbətən hər iki variantda fer- mentin aktivliyi kəskin şəkildə azalmışdır.
Şəkil 1. Quraqlıq şəraitində amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin SHF-da NAD-MDH aktivliyinin dəyişmə dinamikası. A - sitozol, B - xloroplast, C - mitoxondri, MH - mezofil hüceyrələri, ÖTH - örtük topa hüceyrələri, K - kontrol, Q - quraqlıq, OA – oksalasetat.
Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 42
Cədvəl 1. Amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-də ontogenezdə NAD-MDH aktivliyinin subhüceyrə paylanması. Hüceyrə, variant NAD-MDH aktivliyi Xloroplast Sitoplazma Mitoxondri EU/mg zülal % EU/mg zülal % EU/mg zülal % Çiçəkləmə önü MH K 18,3 12,9 62,7 36,5 114,6 50,6 Q 21,5 8,5 58,6 28,6 125,0 62,9
ÖTH K 17,7 8,4 50,4 32,3 125,5 59,3
Q 20,6 5,0 49,4 23,8 133,6 71,2
Çiçəkləmə MH K 21,6 9,63 75,3 35,6 125,5 55,9 Q 26,1 10,8 85,6 35,4 130,4 53,9 ÖTH K 18,0 9,1 51,1 24,3 139,8 66,6
Q 23,4 5,1 79,5 32,6 151,9 62,3
Toxum yetişmə MH K 14,3 8,5 67,5 29.4 135,7 62,1
Q 17,3 3,37 89,4 36,3 148,3 60,3 ÖTH K 6,7 3,29 52,3 25,7 144,4 71,0 Q 7,4 1,6 79,5 34,3 157,0
64,1 Vegetasiyanın sonu MH K 1,0 2,8 16,3 35,6 28,0 62,2 Q 0,5 1,5 12,6 37,9 20,0 60,6 ÖTH K 0,4 0,8 4,5 6,9 60,8 92,3 Q 0,2 0,6 3,5 9,8 31,9 89,6 Qeyd: MH-mesofil hüceyrəsi, ÖTH-örtük topa hüceyrəsi, K-kontrol, Q-quraqlıq
Amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin
mNAD-MDH-sının aktivliyi (Şəkil 1C) bütün ölçülən fazalarda sitozol (Şəkil 1A) və xloroplast (Şəkil 1B) fraksiyalarına nisbətən xeyli yüksək olmuşdur. Quraqlığın təsirindən fermentin aktivliyi artmış, yalnız vegetasiyanın sonunda fermentin ak- tivliyində azalma baş vermiş, amma bu azalma digərləri ilə müqayisədə nisbətən zəif getmişdir. Belə ki, çiçəkləməönü ÇÖ fazada mNAD-MDH- nın zülala görə aktivliyi sitozol və xloroplast fraksiyalarında lokalizasiya olunan fermentin zülala görə ümumi aktivliyindən uyğun olaraq ~2,5 və 8 dəfə, Ç fazasında qeyd olunan bu göstərici sitozol fraksiyadan ~2, xloroplast fraksiyasından isə ~8, bəzən də 10 dəfəyədək yüksək olmuşdur. Vegetasi- yanın sonuna yaxınlaşdıqca bu fərq daha da art- mışdır. Müəyyən olunmuşdur ki, amarant yarpaq- larında NAD-MDH geniş izoferment spektrinə malikdir və quraqlığın təsirindən izoenzim spektrində müəyyən dəyişikliklər baş verir. Belə ki, bitkinin inkişafının çiçəkləmə fazasında yarpağın subhüceyrə fraksiyalarında stresin ilkin vaxtlarında fermentin molekul çəkiləri 58, 63, 68, 72 və 77 kDa olan 5 izoformasının olduğu müşahidə olunmuşdur. Bu izoformalar subhüceyrə fraksiyaları üzrə aşağıdakı kimi paylanmışlar: Kontrolda 58, 63, 68 və 77 kDa m.ç. izoformalar MH-nin, 63 və 72 kDa m.ç. izoformalar isə ÖTH-nin sitozolunda, 63 kDa- luq izoforma MH və ÖTH-nin xloroplastında, 63, 68 və 77 kDa m.ç. izoformalar isə MH və ÖTH-nin mitoxondri fraksiyalarında lokalizasiya olunmuşlar. Çiçəkləməönü və çiçəkləmə fazalarında MH- nin sitozolunda kontrolda NAD-MDH-nın heç bir izoforma dəyişikliyi baş verməmişdir. Çiçəkləmə mərhələsində həmin fraksiyada quraqlığın təsi- rindən 63 və 68 kDa m.ç. izoformalar itmişdir. Toxumyetişmə fazasında isə MH-nin sitozolunda, kontrol variantlarda 63, 68 və 77 kDa m.ç. izoformalar itmiş, yalnız 58 kDa m.ç. izoforma qalmışdır. Bu zaman quraqlığın təsirindən 58 və 77 kDa m.ç. izoformalarla yanaşı 72 kDa m.ç. induktiv izoforma əmələ gəlmişdir. Vegetasiyanın sonunda bütün izoformalar yox olmuş və yalnız kontrolda MH-nin sitozol fraksiyasında 58 kDa m.ç. izoforma saxlanmışdır. MH ilə müqayisədə ÖTH-nin sitozolunda stresin təsirindən baş verən izoenzim dəyişikliyi fərqli olmuşdur. Belə ki, bu fraksiyada çiçəkləmə- önü mərhələdə kontrol və quraqlıq variantlarında 63 və 72 kDa m.ç. malik 2 konstitutiv izoforma vardır. Çiçəkləmə mərhələsində fermentin izofer- ment spektri dəyişmiş və kontrol variantlarda əlavə olaraq 58 və 77 kDa m.ç. 2, quraqlıqda isə 58 kDa m.ç. bir induktiv izoforma əmələ gəlmişdir. To- xumyetişmə mərhələsində isə kontrolda yalnız 58, quraqlıqda isə 58 kDa m.ç. izoforma ilə yanaşı 68 kDa m.ç. induktiv izoforma aşkarlanmışdır. Vege- tasiyanın sonuna doğru bu izoformaların inten- sivliyi kəskin aşağı düşmüşdür. H.Q. Babayev 43
Bitkinin inkişafının çiçəkləməönü və çiçək- ləmə mərhələlərində hər iki toxumanın mitoxondri fraksiyalarında kontrolda NAD-MDH-nın 63, 68 və 77 kDa m.ç. malik olan 3 izoformasından çiçək- ləməönü mərhələdən başlayaraq quraqlıq təsirindən hər iki toxumada 77 kDa m.ç. izoforma yox olmuş, çiçəkləmə mərhələsində isə hər iki toxumada və hər iki variantda 58 kDa m.ç. malik bir ədəd induktiv izoforma aşkarlanmışdır. Toxumyetişmə mərhələsində isə MH və ÖTH- nin mitoxondri fraksiyalarında kontrol variantlarda 58 kDa m.ç. induktiv izoforma yox olmuş və quraqlıq variantlarda isə 58 kDa m.ç. izoforma saxlanmaqla ÖTH-nin mitoxondrilərində 72 kDa m.ç. izoforma yenidən əmələ gəlmişdir. Amarant yarpaqlarının NAD-MDH-nın izofer- ment spektrində yaranan müxtəliflik, görünür hə- min toxumalarda baş verən metabolizm xüsusiy- yətləri və adaptasiya mexanizmləri ilə əlaqədardır. Alınan nəticələr bir daha təsdiq edir ki, C 4 -
olduqlarından və streslə əlaqədar olaraq təkamüldə bitkinin yarpaqlarının anatomik quruluşlarında ya- ranan mürəkkəblik onların ferment sistemlərininin fəaliyyətində və izoferment tərkibində də mürək- kəbliyin yaranmasına səbəb olmuşdur. 1998-ci ildə Berkemeyer və b. Arabidopsis bitkisində plastid NAD-MDH-sının (pNAD-MDH) klonlaşmasını, heteroloji ekspressiyasını öyrənmiş və in vitro xarakteristikasını vermişlər (Berkemeyer et al., 1998). NADF-MDH-dan fərqli olaraq, pNAD-MDH izolə edilmiş xloroplastlarda istər işıqda, istərsə də qaranlıqda aktivdir və işıqda hər iki fermentin aktivliyi eyni səviyyədə olur (Ber- kemeyer et al., 1998). Əvvəlki işlərdə in vitro pNAD-MDH-nın, əsasən, OA-ın malata reduksiya reaksiyasını kataliz etdiyi göstərilmışdir (Cvetić et al., 2008; Beeler et al., 2014). Beləliklə, elektron akseptoru NAD-ın plastidlərin daxilində regene- rasiyasının həyata keçirilməsi pNAD-MDH-nın ən çox ehtimal edilən fizioloji roludur. Beləliklə, yarpağın tənəffüsü zamanı mMDH-nın köməyi ilə əmələ gələn malat reduksiyaedici ekvivalentləri dolayı yolla plastidlərə çatdırır. Qeyd etmək lazım- dır ki, Arabidopsisdə qaranlıqda mMDH-1-də ma- latın miqdarının artması reaksiyanın istiqaməti haq- qında əvvəllər söylənilən fərziyyəni şübhə altına alır. Bu artmanın sadə izahı ondan ibarətdir ki, normal bitkidə gecə pNAD-MDH-sı malatın OA-a oksidləşməsini kataliz edir və beləliklə də NADH əmələ gəlir. Lakin, təbii bitkidə və mMDH-1-də NAD(H) pulunun miqdarı və oksidləşmə vəziy- yətinin eyni olması bu fərziyyəni şübhə altına alır. Lakin ola bilər ki, NAD(H) pulundan keçən axın mMDH-1-də dəyişsə də oksidləşmə vəziyyətində faktiki dəyişiklik yaratmır (Selinski et al., 2014; Beeler et al., 2014).
sNAD-MDH-ları mNAD-MDH-ya nisbətən zəif öyrənilmişdir. sNAD-MDH-sının bir sıra məkik mexanizmlərdə, substratların və reduksi- yaedici ekvivalentlərin sitoplazma ilə digər hüceyrə orqanoidləri arasında mübadiləsində iştirak edir [Yu Ding, Qing-Hu Ma, 2004]. Fermentlərin vacib xassələrindən biridə tempe- ratura həssaslıqdır. Temperatur hüceyrə daxilində ferment sistemlərinin aktivliyinin tənzimində, biokimyəvi çevrilmələrdə, ferment molekulu ilə ferment-substrat kompleksi arasında tarazlığın yaranmasında mühüm rol oynayır (Cook, Cleland, 2007; Cornish-Bowden, 2012).Temperatur fermen- tin stabilliyinə, ferment-substrat kompleksinin parçalanmas sürətinə, fermentin substratla uyğun- luğuna, fermentlə aktivator və inhibitorun yaxın- lığına təsir edir (Cornish-Bowden, 2012). Amarantın inkişafının çiçəkləmə mərhələsində subhüceyrə fraksiyalarında aldığımız nəticələr göstərir ki, bütün fraksiyalarda temperaturun tədri- cən 45
o C-dək yüksəlməsi fermentin aktivliyinin artmasına səbəb olmuşdur (Şəkil 2). 45-55 o C tem- peraturda reaksiyanın sürəti maksimal olmuş, tem- peraturun sonrakıartımında isə reaksiyanın sürəti azalmağa başlamış və 70-80 o C-də minimuma en- mişdir. 60 o C-dən yuxarı temperaturun NAD-MDH aktivliyinə inhibirləşdirici təsiri çox güman ki, ferment zülalının nativ strukturunun denaturasiya ilə əlaqədardır. Müəyyən olunmuşdur ki, MH və ÖTH-nin sNAD-MDH-nın aktivliyi 45-50 o C tem-
peraturda quraqlıq təsirindən kontrolla müqayisədə ~2,5 dəfə yüksək olmuşdur. Bu nəticə quraqlıq təsirindən fermentin zülalının miqdarının artması ilə əlaqədar ola bilər. Ədəbiyyatda bu nəticələrə uyğun nəticələr mövcuddur. Belə ki, ədəbiyyat məlumatlarında müxtəlif mənbədən alınmış MDH- ların optimal temperatur göstəriciləri 30-60 o C intervalı göstərilir (Пинейру и др., 1991). Məlumdur ki, fermentativ reaksiyaların sürəti fermentin substratlarının qatılığından birbaşa asılı- dır (Cornish-Bowden, 2012). Bu məqsədlə yüksək təmizlənmiş ferment preparatı ilə NAD-MDH-nın kataliz etdiyi düzünə və əksinə reaksiyaların sürə- tinin fermentin substratları olan OA və malatın qatılığından asılılığının dəyişmə dinamikası tədqiq olunmuşdur (Cədvəl 2). Cədvəldən göründüyü kimi amarant yarpaqlarının subhüceyrə fraksiyalarında lokalizasiya olunan izoformalar normal suvarma şəraitində OA-ın qatılığı 1,0 mM olduqda reak- siyanı daha yüksək sürətlə kataliz edirlər. Quraq- lığıntəsirinə məruz qalmış variantlarda OA-ın 1,0 mM qatılığında NAD-MDH-nın aktivliyi normal suvarılan bitkilərlə müqayisədə 20% yüksək ol- muşdur.
Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 44
a)
temperaturun NAD-MDH aktivliyinə təsirinin kinetikası. 1 - Kontrol, 2 - Quraqlıq, A - Mixaelis-Menten, B - Arrenius qrafiki, a - MH sitozol, b - MH mitoxondri, c - ÖTH sitozol, d - ÖTH mitoxondri.
H.Q. Babayev 45
Cədvəl 2. Çiçəkləmə fazasında amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin subhüceyrə fraksiyalarında NAD-MDH-nın kataliz etdiyi reaksiyaların bəzi kinetik parametrləri.
1,54 80,72 17 205 0,156 80 3,9 42 1,5 38 Q 1,89 91,03 20 219 0,16 130 4,2 99 2,1 98 Xlp K 3,2 12,02 9 22 0,25 71 6,5 13,6 3,0 10,5 Q 2,9 9,53 11 19,5 0,2 62 6,3 10,6 2,8 9,32 Mit K 2,5 30,8 12,5 101 0,17 140 2,8 128 1,3 127,1
3,30 40,01 11,4 185 0,2 160 4,0 134 1,2 131,2 ÖTH Sit K 1,94 80.76 23,5 230 0,148 80,1 4,8 79,1 1,25 75 Q 1,7 100,2 22,5 239 0,15 99,0 4,5 99,1 2,25 96 Xlp K 1,3 23,03 11,5 35,0 0,3 24 4,2 22,8 1,6 21,6 Q 1,4 23,61 11,8 42,2 O,25 34 4,06 20,96 1,4 20,6 Mit K 1,5 134.2 4,3 123 0,18 140 4,7 131,2 1,2 127 Q 2,0 141.7 5,2 149 0,16 160 6,0 137,9 0,9 133,6 Qeyd: Sit - sitozol fraksiyasə, Xlp – xloroplast fraksiyası, Mi t - mitoxondri fraksiyası.
Cədvəldən göründüyü kimi amarant bitkisinin MH-nin sitozolunda kontrolda K m OA=1,54 mM, V max
OA=80,7 EU/mq zülal, quraqlıqda K m OA=1,89 mM, V max
OA=91 EU/mq zülal olduğu halda MH-nin mitoxondrilərində kontrolda K m OA=2,5 mM, V max
OA=30,8 EU/mq zülal, quraqlıqda K m OA=3,3 mM, V max
OA=40,1 EU/mq zülal olmuşdur. Amarantın ÖTH-də kontrolda sitozolda K m OA=
1,94 mM, V max
OA=80,7 EU/mq zülal, quraqlıqda K m OA=1,7 mM, V max
OA=100,2 EU/mq zülal olduğu halda ÖTH-nin mitoxondrilərində kontrolda K m
max OA=134,2 EU/mq zülal, quraqlıqda K m OA=2,0 mM, V max OA=141,7 EU/mq zülal olmuşdur. Alınan nəticələri analiz etdikdə məlum olur ki, amarant bitkisinin yarpaqlarında NAD-MDH-nın kataliz etdiyi reaksiyanın OA-a görə K m -ləri buğda sortlarının flaq yarpaqlarındakı həmin göstəricidən aşağı qiymətə malik olub 1,2-2,1 mM aralığında yerləşir. Amarant yarpaqlarının ÖTH-də baş verən həmin reaksiyanın V max -u isə buğdanın flaq yarpaqlarının MH-nin subhüceyrə fraksiyaları ilə müqayisədə 3-5 dəfə çoxdur. Amarantın ÖTH-də V max
OA MH-dəki V max
OA-dan həmişə yüksək olmuşdur. Q təsirindən K ilə müqayisədə bu fərq daha da artmışdır. Amarantın MH-nin SHF-ı arasın- da sitozol fraksiyada V max mitoxondri fraksiyasına nisbətən ~2 dəfə çox olmuşdur. Amarant yarpaqla- rında MH ilə ÖTH-nin sitozol fraksiyalarında kontrol və quraqlıq variantlarında K m və V max -lar
təqribən bir-birlərinə bərabər olsalar da ÖTH-nin mitoxondri fraksiyasında V max OA MH-nin mito- xondri fraksiyasına nisbətən ~3-4 dəfə yüksək olmuşdur. Alınan nəticələr MDH-nın OA-a qarşı yüksək, malata qarşı isə aşağı həssaslığının olduğunu göstərir ki, bu da başqa tədqiqatçıların nəticələri ilə uyğunluq təşkil edir. Əvvəllər aparılmış tədqiqat- larda göstərirlər ki, malata qarşı fermentin aşağı həssaslığa malik olması malatın katalitik çevrilməsi zamanı fermentin konformasiya dəyişkənliyi ilə əlaqədardır (Wisemann et al., 1991; Сатар и др., 2010). K
qiymətlərinin müqayisəsi göstərir ki, sNAD-MDH malata qarşı OA-la müqayisədə az uyğunluq göstərir. K m qiymətləri bitkinin növün- dən, mübadilənin tipindən, hüceyrə daxilində yerinə yetirdiyi funksiyasından və boyümə şəraitindən asılı olaraq dəyişə bilir. NAD-MDH fermentinin ayrı-ayrı izoformaları xüsusi aktivliyinə, reaksiyanın sürətinə, düzünə və əksinə gedən reaksiyanın katalitik effektivliyinə görə biri-birindən fərqlənirlər. Düzünə və əksinə gedən reaksiyada NAD-MDH-nın kinetik para- metrlərinə görə fərqlənən 2 müxtəlif konformasion vəziyyətdə olur (Блюменфельд, Плешанов, 1986). Malatın oksidləşməsi əlavə energetik baryerin ara- dan qaldırılması və katalitik akt zamanı mole- kulların strukturunda əhəmiyyətli konformasiya dəyişikliklərin baş verməsi ilə müşayiət olundu- ğuna görə reaksiya sabit sürətlə baş vermir. Malat həyacanlanmış vəziyyətindən sakit vəziyyətinə ke- çərək ayrılan hidrogen ionunu kofermentə ötürərək substrat molekulu ilə MDH birləşməsinə şərait yaradır. Yalnız reaksiya məhsulları ayrıldıqdan və MDH molekulu başlanğıc konformasiya vəziy- yətinə qayıtdıqdan sonra substratın yenidən kata- litik çevrilməsi baş verir. Bu keçidlərlə əlaqədar olaraq katalitik prosesin sürəti zəifləyir. OA-ın çevrilmə reaksiyası fermentin strukturunda baş verən konformasiya dəyişkənlikləri ilə əlaqədar deyildir. Alınan nəticələr əsasında belə bir mülahizə yürütmək olar ki, su stresi şəraitində ağızcıqların Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 46
bağlanması ilə əlaqədar olaraq bitkilərdə yaranan CO 2 qıtlığının qarşısını almaq üçün bitkilərin istifadə etdiyi alternativ yollardan biri hüceyrələrdə MDH-lar hesabina C 4 -turşuların sintezinin sürətlən- məsidir. Mitoxondri NAD-MDH-sının aktivliyinin artması mitoxondrilərdə C 4 -turşuların sintezini artırır. C 4 -turşuların sintezinin artması quraqlıqda ağızcıqların bağlandığı və qaz mübadiləsinin zəif- lədiyi şəraitdə karbon qatılaşdıran mexanizmin işə düşməsinə səbəb olur ki, bunun da nəticəsində Kalvin dövranı CO 2 ilə təmin edilir (Amthor, 2010; Wang et al., 2014).
ƏDƏBİYYAT Бальнокин Ю.В., Котов А.А., Мясоедов Н.А., Хайлова Г.Ф., Куркова Е.Б., Леньков Р.В., Котова Л.М. (2005) Участие дальнего транс- порта Na
+ в поддержании градиента водного потенциала в системе среда-корень-лист у галофита Suaeda altissima. Физиология расте- ний, 52: 549-557. Блюменфельд Л.А., Плешанов П.Г. (1986) Единичные циклы прямой ферментативной реакции напримере МДГ. Биофизика, 30(5): 760-763. Пинейру де Корвалью М.А.А., Землянухин А.А., Епринцев А.Т. (1991) Малатдегидро- геназа высших растений. М.А.А. Пинейру де Корвалью, A.A. Землянухин, А.Т. Епринцев. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та., 216 с. Сатар А.Ф., Парфенова И.В., Мальцева Е.В., Фалалеева М.И., Епринцев А.Т. (2010) Кине- тические характеристики тетрамерной формы малатдегидрогеназы, полученной с использо- ванием ионообменной хроматографии, из животных и бактерий. Сорбционные и хрома-
on the potential efficiency of converting solar radiation to phytoenergy. New Phytologist., 188: 939-959. Beeler S., Liu H-C., Stadler M., Schreier T., Eicke S., Lue W-L., Truernit E., Zeeman S.C., Chen J., Kötting O. (2014) Plastidial NAD- dependent malate dehydrogenase is critical for embryo development and heterotrophic meta- bolism in Arabidopsis. Plant Pysiology., 164: 1175-1190.
(1998) A novel, non-redoxregulated NAD-depen- dent malate dehydrogenase from chloroplasts of
27927-27933. Cook P., Cleland W. (2007) Enzyme kinetics and mechanism. New York, USA: Garland Sci., 416 p. Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of enzy- me kinetics. New York, USA: Wiley-Blackwell, 510 p.
(2008) Characterization of NAD-dependent mala- te dehydrogenases from spinach leaves. Proto-
(2010) Radically rethinking agriculture for the 21st century. Science, 327: 833–834. Flexas J., Bota J., Galmes J. et al. (2006) Keeping a positive carbon balance under adverse condi- tions: responses of photosynthesis and respiration to water stress. Physiologia Plantarum, 127: 343- 352.
cellular locations and role in the flow of meta- bolites between the cytoplasm and cell organelles.
localization of two carbonic anhydrase from Amaranthus cruentusleaves. Russian Journal of Plant Physiology, 50(2): 213-219. Laemmli U. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259): 680-685.
II under environmental stress. Biochem. et Biophys. Acta, 258: 100-107. Nunes-Nesi A., Carrari F., Gibon Y. et al. (2007) Deficiency of mitochondrial fumarase activity in tomato plants impairs photosynthesis via an effect on stomatal function. Plant J., 50(6): 1093-106. Sedmak, J., Grossberg, S. (1977) A rapid, sensi- tive and versatile assay for protein using Coomas- sie brilliant blue G-250. Anal. Biochem., 79: 544- 552.
Selinski J., Konig N., Wellmeyer B. et al. (2014) The plastid-localized NAD-dependent malate dehydrogenase is crucial for energy homeostasis in developing Arabidopsis thaliana seeds. Mol. Plant., 7: 170–186. Scheibe R., Stitt M. (1988) Comparison of NADP- malate dehydrogenase activation, QA reduction and O 2
Biochem., 26: 473–481. Tomaz T., Bagard M., Pracharoenvwattana I., et al. (2010) Mitochondrial malate dehydrogenase lowers leaf respiration and alters photorespiration and plant growth in Arabidopsis. Plant Physi-
(2014) Thre distinct biochemical subtypes of C 4
Botany, 53(7): 3568-3578. H.Q. Babayev 47
Wisemann M., McKay D., Crow K. et al. (1991) Rat liver mitochondrial malate dehydrogenase: purification? Kinetic properties, and role in ethanol metabolism. Arch. Biochem. Biophys., 290(3): 191-196. Yashvant P., Ram N., Kumari S. et al. (2013) A new antibiotic resistant mutant of Pleurotus sajor- caju with improved expression of malate dehydrogenase enzyme. IJALS, 6(1):36-43. Yu Ding, Qing-Hu M. (2004) Characterization of a cytosolic malate dehydrogenase cDNA which encodes an isizyme toward oxaloacetate reduction in wheat. Biochimie., 86: 509-518.
Фракций Листьев Амаранта В Условиях Засухи Г.Г. Бабаев Институт молекулярной биологии и биотехнологии НАНА
Изучены локализация, изоферментный спектр, некоторые физико-химические и кинетические свойства НАД-малатдегидрогеназы (L-малат-НАД-оксидоредуктаза, НАД-МДГ, КФ 1.1.1.37) в цитозольных и митохондриальных фракциях мезофильных (М) и обкладочных клеток (ОК) амаранта в фазах цветения и созревания зерна под воздействием засухи. В зависимости от фазы развития и типа ткани НАД-МДГ имеет широкий изоферментный спектр, и под действием засухи наблюдаются выраженные изменения в количестве изоферментов, в ферментативной активности, а также в физико-химических и кинетических свойствах фермента. Значение V max ОАА для цитоплазматической НАД-МДГ (цНАД-МДГ) в 2 раза больше, чем для митохондриальной НАД- МДГ (мНАД-МДГ). Все изоформы фермента имеют широкий оптимум рН и устойчивы к действию температуры. В зависимости от субклеточной фракции фермент проявляет высокую чувствительность к своему сусбтрату – OAA и низкую чувствительность к малату. Реакция, катализируемая НАД-МДГ, в основном подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментена, и фермент не является аллостерическим. Активность фермента строго регулируется промежуточными субстра- тами и одно- и двухвалентными ионами.
Fractions of Amaranth Leaves Under Drought H.G. Babayev Institute of Molecular Biology and Biotechnology, ANAS Localization, isoenzyme spectrum, some physicochemical and kinetic properties of NAD-malate dehydrogenase (L-malate-NAD-oxidoreductaseNAD-MDH, EC 1.1.1.37) have been studied in cytosolic and mitochondrial fractions of mesophyll (M) and bundle sheath cells (BSC) of amaranth leaves during the flowering and grain ripening phases under drought. Depending on the growth phase and tissue type NAD- MDH has a wide isoenzyme spectrum and pronounced alterations were observed in the isoenzyme number and the enzyme activity and also in physicochemical and kinetic properties. V max
OAA for cytoplasmic NAD-MDH (sNAD-MDH) was 2 times more than that of mitochondrial NAD-MDH (mNAD-MDH). All isoforms of the enzyme have a wide pH optimum and are temperature tolerant. Depending on the subcellular fraction the enzyme is highly sensitive to OAA and manifests low sensitivity to malate. The reaction catalyzed by NAD-MDH generally follows Michaelis-Menten kinetics and the enzyme is not allosteric. The enzyme activity is strongly regulated by intermediate substrates and divalent ions. Key words: Amarant, mesophyll cells, bundle sheath cells, NAD-malatdehydrogenase, isoform, localization, drought, adaptation Yüklə 133,09 Kb. Dostları ilə paylaş:
|