S h o r t c o m m u n I c a t I o n detecting pigments from colourful eggshells of extinct birds Branislav Igic •

---

S H O R T C O M M U N I C A T I O N

Detecting pigments from colourful eggshells of extinct birds

Branislav Igic

•

David R. Greenwood

•

David J. Palmer

•

Phillip Cassey

•

Brian J. Gill

•

Tomas Grim

•

Patricia L. R. Brennan

•

Suzanne M. Bassett

•

Phil F. Battley

•

Mark E. Hauber

Received: 10 November 2009 / Accepted: 15 December 2009

Ó Birkha¨user Verlag, Basel/Switzerland 2009

Abstract

The known chemical basis of diverse avian

eggshell coloration is generated by the same two classes of

tetrapyrrole pigments in most living birds. We aimed to

extend the evolutionary scope of these patterns by detect-

ing pigments from extinct birds’ eggs. In our samples

biliverdin was successfully extracted from subfossil shell

fragments of the blue-green egg-laying upland moa

Megalapteryx didinus, while protoporphyrin was extracted

from the beige eggs of two other extinct moa species. Our

data on pigment detection from eggshells of other extant

paleognath birds, together with published information on

other modern lineages, confirm tetrapyrroles as ubiquitous

and conserved pigments contributing to diverse eggshell

colours throughout avian evolution.

Keywords

Egg matrix

Á Pigmentation Á Radiation Á

Ratite

Introduction

Avian eggshells are some of the most diversely coloured

natural materials (Kilner

2006

). Despite analytical advan-

ces in the chemical characterisation of pigments, the

B. Igic

Á D. R. Greenwood Á D. J. Palmer Á

P. F. Battley

Á M. E. Hauber

School of Biological Sciences, University of Auckland,

Auckland, New Zealand

B. Igic

e-mail: [e-mail]; [e-mail]

D. J. Palmer

e-mail: [e-mail];

[e-mail]; [e-mail]

D. R. Greenwood

Plant and Food Research, University of Auckland,

Mt. Albert Campus, Auckland, New Zealand

e-mail: [e-mail]

P. Cassey

School of Biosciences, University of Birmingham,

Birmingham, UK

e-mail: [e-mail]

B. J. Gill

Auckland War Memorial Museum, Auckland, New Zealand

e-mail: [e-mail]

T. Grim

Department of Zoology and Laboratory of Ornithology,

Palacky University, Olomouc, Czech Republic

e-mail: [e-mail]

P. L. R. Brennan

Department of Ecology and Evolutionary Biology,

Peabody Museum, Yale University, New Haven, USA

e-mail: [e-mail]

S. M. Bassett

Department of Zoology, University of Otago,

Dunedin, New Zealand

e-mail: [e-mail]

P. F. Battley

Ecology Group, Massey University,

Palmerston North, New Zealand

e-mail: [e-mail]

M. E. Hauber (

&)

Department of Psychology, Hunter College,

CUNY, New York, USA

e-mail: [e-mail]

Chemoecology

DOI 10.1007/s00049-009-0038-2

CHEMOECOLOGY

---

diversity of birds’ egg colours has been solely attributed to

pyrroles (reviewed in Gorchein et al.

2009

). In birds, the

bile pigment biliverdin produces the blue-green human-

visible appearance of eggs while protoporphyrin (Miksik

et al.

1996

) is typically detected from red-brown maculated

eggs. Immaculate eggs of diverse colours can contain either

or both biliverdin and protoporphyrin, while white eggs

may contain one, both, or no detectable pigments at all

(Kennedy and Vevers

1976

).

We aimed to extend the comparative scope of prior

published pigment analyses by examining subfossil frag-

ments from an extinct avian lineage. Amongst paleognath

birds, most species of New Zealand’s moa (Dinornithidae/

Emeidae) laid eggs whose remains appear grey to beige to

human observers (Gill

2007

). In contrast, eggshell frag-

ments attributed to the Upland Moa (Megalapteryx didinus;

Megalapterygidae; Bunce et al.

2009

), are typically pale to

bright green to the human eye (Fig.

1

a). One extraordinary

specimen of this species is a near-complete skeleton of a

female, confirmed by nuclear DNA sequences (Huynen

et al.

2003

), that surrounded an apparently unlaid blue egg

(Gill

2007

).

Here we used modern chemical techniques to determine

whether biliverdin and protoporphyrin could be detected in

colourful subfossil moa eggs. Although all taxa of the

diverse moa radiation have been extinct for over 500 years,

their mating systems, size dimorphism patterns, and

plumage colours have been the subject of several recent

Ratite taxon:

F

Struthio camelus

D

Euryapteryx curtus

C

Dinornithidae/Emeidae spp

40

60

80

B

Megalapteryx didinus (AV10049)

A

Megalapteryx didinus (AV7477)

E

Dromaius novaehollandiae

0

20

Reflectance (%)

G

300

350

400

450

500

550

600

650

700

Wavelength (nm)

Fig. 1 a

–f Representative

eggshell fragments (white scale

bar 1 cm for a–d and 2 cm for

e

, f) and g reflectance spectra of

extinct and extant ratites

included in our analysis

B. Igic et al.

---

discoveries using ancient DNA and microscopy-based

techniques (e.g. Bunce et al.

2003

, Turvey et al.

2005

,

Rawlence et al.

2009

). This continued interest in moa

renders them a highly desirable focal lineage for new

analyses of the chemical basis of egg coloration. However,

as eggshells’ appearances both change over time, even

when specimens are stored in museums (Starling et al.

2006

), and vary with environmental conditions at the time

of laying (Aviles et al.

2007

), in the absence of a known

time series of moa eggs and their colours, our tests nec-

essarily remain exploratory.

Methods

Sample description

Three moa eggshell samples were kindly provided by

Otago

Museum,

New

Zealand:

(1)

green

eggshell

(AV7477), attributed to Megalapteryx didinus, from Chatto

Creek, Central Otago, South Island; (2) blue eggshell

(AV10049) of the unlaid M. didinus egg from Mount

Aspiring National Park, South Island; (3) beige moa egg-

shell (AV7371, species unidentified) from Central Otago,

South Island. Upland Moa remains are known only from

the South Island (Tennyson and Martinson

2006

), and so

we sourced a fourth moa eggshell fragment from the North

Island of New Zealand (Auckland Museum LB12048),

beige, probably of Euryapteryx curtus, from Tokerau

Beach, Northland.

For a comparison with extant paleognath birds, we

extracted pigments from eggshell fragments from extant

ratites, including the following samples: (1) a fresh farmed

ostrich egg Struthio camelus; (2) a fresh farmed emu egg

Dromaius novaehollandiae; (3) two North Island Brown

Kiwi Apteryx mantelli eggs hatched successfully in cap-

tivity at Rainbow Springs, Rotorua, (1)–(3) all sourced in

New Zealand; (4) a farmed Greater Rhea Rhea americana

egg purchased from a store in Berkeley, USA; (5) a fresh

captive Chilean Tinamou Nothoprocta perdicaria egg from

British Columbia, Canada, and (6) a fresh Great Tinamou

egg Tinamus major from a nest at La Selva, Costa Rica

(Brennan

2009

).

Colour analyses

All eggshell fragments were washed with 70% ethanol and

air dried. Each sample was photographed with a digital

camera and, using Image J 1.40 (National Institute of

Health, USA) to calculate surface areas. We collated

published information on the human-perceived colours of

each species’ eggs (Walters

1994

; Gill

2007

). To record

physical measures of appearance, prior to destructive

chemical analysis, the reflectance of eggshells for extinct

moa and two extant ratites was also documented following

Cassey et al. (

2009

) (Fig.

1

).

Pigment analysis

We followed the extraction protocol for eggshell pigments

given in Kennedy and Vevers (

1976

). Each eggshell sam-

ple of measured area (maximum * 1 cm

2

) was dissolved

in fresh 5% sulphuric acid in methanol and steeped for

1–2 days (no longer than 2) before filtering through 1 mL

barrier pipette tips (Axygen Biosciences) under slight

pressure. The acidified methanolic filtrate was extracted

into dichloromethane/methanol/water (1:2:1 v/v/v) three

times recovering the lower phase of the organic layer each

time, then once in 10% sodium chloride solution and twice

with water, ensuring the pH of the final water wash was

above 5. The organic solution was evaporated to dryness

under a stream of nitrogen and dissolved in 1 ml of

methanol. An aliquot was measured in an Agilent 8453

diode array spectrophotometer for its absorption spectrum

from 220 to 1,000 nm versus methanol (as a blank).

An indicator of the pigments present was evident from

these spectra and then confirmed by mass spectrometry. To

assign the presence or absence of biliverdin and proto-

porphyrin we used, high-resolution accurate mass infusion

mass spectrometry on a ThermoFinnigan LTQ FTMS ion

cyclotron resonance (ICR) mass spectrometer operating in

electrospray mode. We employed tandem mass spectrom-

etry (MS

n

) analysis with helium as the collision-induced

dissociation gas on diluted methanolic samples using sev-

eral diagnostic ions in the ion-trap (see below) followed by

accurate mass using a resolution of 100,000 (at m/z 400) in

the ICR cell on these ions when present in sufficient con-

centration. Several orders of magnitude of concentration

(*10

6

) were discernable through this approach, confirming

the identity of the pigments though their diagnostic daughter

ion fragments and atomic composition with accurate mass

values less than 2 ppm.

A quantitative assessment of both biliverdin and proto-

porphyrin was also conducted for a separate subset of the

available shells using the same pigment extraction protocol

followed by analysis on an ion-trap mass spectrometer.

Samples were analysed by flow injection analysis using

an Agilent 1100 series capillary HPLC, delivering

95% methanol with 0.1% formic acid at a flow rate of

20 lL/min and coupled to an Agilent ion-trap mass

spectrometer model SL with an electrospray ionization

interface. Biliverdin IXa dimethyl ester and protoporphyrin

IX dimethyl ester were quantified simultaneously by mul-

tiple reaction monitoring; simply protonated biliverdin IXa

dimethyl ester was isolated at m/z 611.4 and was quantified

using the fragment at m/z 311.1, fragments at m/z 209.1 and

Detecting pigments from colourful eggshells of extinct birds

---

m/z 283.2 were used as qualifier ions, simply protonated

protoporphyrin IX dimethyl ester was isolated at m/z 591.3

and was quantified using the fragment of m/z 513.3, frag-

ments at m/z 485.3 and m/z 445.3 were used as qualifier

ions. Biliverdin IXa dimethyl ester and protoporphyrin IX

dimethyl ester obtained from Frontier Scientific Inc.

(Logan, Utah) were used as standards and they gave a

linear response over the range 8 fmol to 2.4 pmol.

For the quantitative assessment measurements, we

standardised the detected pigment concentrations to egg-

shell fragment size used in extractions by dividing

measurements by eggshell sample area to calculate pig-

ment concentration as pmol/cm

2

. We consider this

appropriate because pigments are predominantly found

within the eggshell cuticle (Miksik et al.

2007

). Presence of

compounds is reported only for samples where detected

concentrations were elevated relative to internal controls.

To describe quantitative data, we compared the findings

from moa explicitly with our result from eggs of emu (a

known source of biliverdin, but not protoporphyrin) and

ostrich (a known source of protoporphyrin but not bili-

verdin) (Kennedy and Vevers

1976

).

Results

Detection of biliverdin

The result of our two detection techniques allowed us to

identify the presence of biliverdin from shell samples of

two different Upland Moa eggs, but not of the other two

moa taxa in our sample (Table

1

). The concentration

of recovered biliverdin from the eggshell samples was

0.21 pmol/cm

2

from Upland Moa AV10049, which was

two magnitudes lower than that recovered from the emu

(19.8 pmol/cm

2

) and 20 times higher than that from the

ostrich (0.001 pmol/cm

2

).

Detection of protoporphyrin

We successfully detected protoporphyrin from the beige

eggshells of both the South Island moa (0.30 pmol/cm

2

)

and the North Island moa (0.37 pmol/cm

2

) samples. These

concentrations were similar in magnitude to that of proto-

porphyrin detected from the ostrich eggshell (0.10 pmol/

cm

2

). We did not detect protoporphyrin above instrumental

threshold in either the green or the blue shells of Upland

Moa or the emu sample.

Discussion

Despite the small number of taxa and shell fragments

available to us, a necessary corollary of our methods to

destructively sample museum specimens of extinct species,

we detected the pigments biliverdin and protoporphyrin

from different subfossil eggshells of extinct birds. All of

the moa fragments were collected from different localities

and had been stored in different storage units or facilities

prior to analysis and we positively detected both classes of

pigments from different specimens. Nonetheless, it remains

possible that the reported patterns of pigment detection are

due to environmental contaminants or chemical and phys-

ical changes to the pigments on and inside the eggshell

matrix that occurred during the unknown period between

egg formation and laying and the time of pigment extrac-

tion in this study. For example, there was disagreement

in the positive detection of biliverdin between our two

Table 1

Outputs of two analytical detection protocols of biliverdin from extinct and extant paleognath bird eggshell samples available for

destructive sampling

Taxon

High-resolution accurate mass

infusion mass spectrometry

Liquid chromatography-

mass spectrometry

Combined

detection

Human-perceived

eggshell colour

Dinornithidae/Emeidae spp.

a

n/c

No

No

Beige

Megalapteryx didinus (AV10049)

a

n/c

Yes

Yes

Blue

Megalapteryx didinus (AV7477)

a

Yes

No

Yes

Green

Euryapteryx curtus

a

n/c

No

No

Beige

Struthio camelus

No

No

No

Beige

Apteryx mantelli

No

n/c

No

White/blue

Dromaius novaehollandiae

Yes

Yes

Yes

Green

Rhea americana

Yes

n/c

Yes

White/blue

Nothoprocta perdicaria

Yes

n/c

Yes

Brown

Tinamus major

Yes

n/c

Yes

Blue

n/c refers to analyses not conducted

a

Extinct taxa

B. Igic et al.

---

analytical methods when destructively sampling two dif-

ferent fragments of the green Upland Moa egg (Table

1

),

implying a sensitivity to sample identity of the detection

protocols.

We cannot be certain of either the original coloration of

the extinct birds’ eggs, nor the interpretation of negative

chemical detection results in our analyses here. Nonethe-

less, following the directional predictions of published

results on patterns of human-assessed coloration and bili-

verdin detection in the eggshells of modern bird species

(Kennedy and Vevers

1976

; Moreno et al.

2006

), we also

found a consistent association of human-perceived blue-

green eggshell colours with the presence of biliverdin from

the combined ratite and tinamou eggs in our samples at the

species level (G

2

= 2.8, p = 0.045, 1-tailed; Table

1

).

It is unknown whether moa, or their competitors, para-

sites and predators (Cassey et al.

2008

), had evolved to

perceive and behaviourally discriminate between diverse

eggshell colours (Reynolds et al.

2009

). Irrespective of any

potential adaptive function of diverse egg colours, paleo-

neurological data already suggest that visual perception

was more important for moa compared to their nocturnal

kiwi relatives in New Zealand (Corfield et al.

2008

), per-

haps in the context of their diverse plumage colours

(Rawlence et al.

2009

) and/or herbivorous foraging tactics

(Fadzly et al.

2009

) of the different moa species. Our

research thus contributes to recent advances in research on

the behavioural and sensory ecology of extinct animal

lineages, including genetic and microscopic analyses of

sexual dimorphism in growth (Bunce et al.

2003

), behav-

ioural reconstruction of nesting patterns (Varricchio et al.

2008

), and neuroanatomical correlates of sensory functions

(Zelenitsky et al.

2009

; Patek and Oakley

2003

).

The discovery of biliverdin and protoporphyrin in

moa eggshells is consistent with a ubiquitous role of tet-

rapyrroles generating eggshell colours throughout avian

evolution (Kennedy and Vevers

1976

; Gorchein et al.

2009

). Physiologically and biochemically, the evolution-

arily ubiquitous and conserved role of pyrroles contributing

to eggshell coloration is mechanistically feasible because

both classes of the dominant tetrapyrrole pigments of

eggshells, are involved in the general synthesis and

catabolism of vertebrate haem, and are likely deposited as

de novo metabolites in the avian shell gland (Wang et al.

2009

).

There are repeated suggestions, based on phylogenetic

reconstruction and comparison with reptiles, that the

ancestral avian eggshell was white and immaculate

(reviewed in Kilner

2006

), in parallel with the pigment-free

white coloration of the calcium carbonate matrix of croc-

odilian eggs (our own unpublished data). Nevertheless, our

results from extinct bird eggs expand on the scope of this

conclusion as it seems likely that pyrrole eggshell pigments

are both ancient in origin and highly conserved throughout

the diverse radiations of birds. It remains to be shown what

the structural, chemical, and biological mechanisms are

that result in pigmented eggshell types and what role these

pigments play in the protein network of the eggshell matrix

(Sharp and Silyn-Roberts

1984

).

Acknowledgments

We are grateful to the School of Biological

Sciences at the University of Auckland for major support. We thank

D. Dearborn, M. Hyland, C. Moskat, H. Silyn-Roberts, The Univer-

sity of Auckland Vice-Chancellor’s Development Fund and the

Human Frontier Science Program (to P.C., T.G. and M.E.H.) for

assistance, discussions, and funding.

References

Aviles JM, Stokke BG, Moksnes A, Roskaft E, Moller AP (2007)

Environmental conditions influence egg color of reed warblers

Acrocephalus scirpaceus and their parasite, the common cuckoo

Cuculus canorus. Behav Ecol Sociobiol 61:475–485

Brennan PLR (2009) Incubation behavior of great tinamous (Tinamus

major). Wilson J Ornithol 121:506–511

Bunce M, Worthy TH, Ford T, Hoppitt W, Willerslev E, Drummond

A, Cooper A (2003) Extreme reversed sexual size dimorphism in

the extinct New Zealand moa Dinornis. Nature 425:172–175

Bunce M, Worthy TH, Phillips MJ, Holdaway RN, Willerslev E,

Haile J, Shapiro B, Scofield RP, Drummond A, Kamp PJJ,

Cooper A (2009) The evolutionary history of the extinct ratite

moa and New Zealand Neogene paleogeography. Proc Natl Acad

Sci USA 106:20646–20651

Cassey P, Honza M, Grim T, Hauber ME (2008) The modeling of

avian visual perception predicts behavioural rejection responses

to foreign egg colours. Biol Lett 4:515–517

Cassey P, Ewen JG, Marshall NJ, Vorobyev M, Blackburn TM,

Hauber ME (2009) Are avian eggshell colours effective intra-

specific

communication

signals?

A

perceptual

modeling

approach. Ibis 151:689–698

Corfield JR, Wild JM, Hauber ME, Parsons S, Kubke MF (2008)

Evolution of brain size in the Palaeognath lineage, with an

emphasis on New Zealand ratites. Brain Behav Evol 71:87–99

Fadzly N, Jack C, Schaefer HM, Burns KC (2009) Ontogenetic colour

changes in an insular tree species: signalling to extinct browsing

birds? New Phytol 184:495–501

Gill BJ (2007) Eggshell characteristics of moa eggs (Aves: Dinor-

nithiformes). J R Soc N Z 37:139–150

Gorchein A, Lim CK, Cassey P (2009) Extraction and analysis of

colourful eggshell pigments using HPLC and HPLC/electrospray

ionization tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr

23:602–606

Huynen L, Millar CD, Scofield RP, Lambert DM (2003) Nuclear

DNA sequences detect species limits in ancient moa. Nature

425:175–178

Kennedy GY, Vevers HG (1976) A survey of eggshell pigments.

Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 55:117–123

Kilner RM (2006) The evolution of egg colour and patterning in birds.

Biol Rev 81:383–406

Miksik I, Holan V, Deyl Z (1996) Avian eggshell pigments and their

variability. Comp Biochem Physiol B 113:607–612

Miksik I, Eckhardt A, Sedlakova P, Mikulikova K (2007) Proteins of

insoluble matrix of avian (Gallus gallus) eggshell. Connect

Tissue Res 48:1–8

Moreno J, Lobato E, Morales J, Merino S, Tomas G, Martinez-de la

Puente J, Sanz JJ, Mateo R, Soler JJ (2006) Experimental

Detecting pigments from colourful eggshells of extinct birds

---

evidence that egg color indicates female condition at laying in a

songbird. Behav Ecol 17:651–655

Patek SN, Oakley TH (2003) Comparative tests of evolutionary

tradeoffs in a palinurid lobster acoustic system. Evolution

57:2082–2100

Rawlence NJ, Wood JR, Armstrong KN, Cooper A (2009) DNA

content and distribution in ancient feathers and potential to

reconstruct the plumage of extinct avian taxa. Proc R Soc Lond

B 276:3395–3402

Reynolds SJ, Martin GR, Cassey P (2009) Is sexual selection blurring

the functional significance of eggshell coloration hypotheses?

Anim Behav 78:209–215

Sharp RM, Silyn-Roberts H (1984) Development of preferred

orientation in the eggshell of the domestic fowl. Biophys J

46:175–179

Starling M, Heinsohn R, Cockburn A, Langmore NE (2006) Cryptic

gentes revealed in pallid cuckoos Cuculus pallidus using reflec-

tance spectrophotometry. Proc R Soc Lond B 273:1929–1934

Tennyson A, Martinson P (2006) Extinct birds of New Zealand. Te

Papa Press, Wellington

Turvey ST, Green OR, Holdaway RN (2005) Cortical growth marks

reveal extended juvenile development in New Zealand moa.

Nature 435:940–943

Varricchio DJ, Moore JR, Erickson GM, Norell MA, Jackson FD,

Borkowski JJ (2008) Avian paternal care had dinosaur origin.

Science 322:1826

Walters M (1994) Birds’ eggs. Dorling Kindersley, London

Wang XT, Zhao CJ, Li JY, Xu GY, Lian LS, Wu CX, Deng XM

(2009) Comparison of the total amount of eggshell pigments in

Dongxiang brown-shelled and Dongxiang blue-shelled eggs.

Poult Sci 88:1735–1739

Zelenitsky DK, Therrien F, Kobayashi Y (2009) Olfactory acuity in

theropods: palaeobiological and evolutionary implications. Proc

R Soc Lond B 276:667–673

B. Igic et al.

---

Document Outline

• Detecting pigments from colourful eggshells of extinct birds
  • Abstract
  • Introduction
  • Methods
    • Sample description
    • Colour analyses
    • Pigment analysis
  • Results
    • Detection of biliverdin
    • Detection of protoporphyrin
  • Discussion
  • Acknowledgments
  • References