Įvadas genomika yra rūšies viso genomo molekulinė analizė



Yüklə 461 b.
tarix17.01.2018
ölçüsü461 b.
#21309



ĮVADAS

  • Genomika yra rūšies viso genomo molekulinė analizė

    • Genomo analizę sudaro dvi pagrindinės fazės
      • Genolapio sudarymas
      • Sekvenavimas (nukleotidų sekos nustatymas)
  • 1995 m. mokslininkai vadovaujami Craigo Venterio ir Hamiltono Smitho nustatė pirmojo organizmo pilną DNR seką





1996 m. buvo pabaigtas pirmojo eukariotinio organizmo genomo tyrimas. Jį atliko pasaulinis mokslininkų konsorciumas, vadovaujamas Andre Goffeau iš Belgijos

  • 1996 m. buvo pabaigtas pirmojo eukariotinio organizmo genomo tyrimas. Jį atliko pasaulinis mokslininkų konsorciumas, vadovaujamas Andre Goffeau iš Belgijos

    • Saccharomyces cerevisiae
    • Genomą sudaro 16 linijiškų chromosomų
      • ~ 12 milijonų bp, ~ 6,200 genų
  • Vėliau buvo sekvenuoti kitų organizmų genomai, įskaitant žmogų

  • Struktūrinė genomika prasideda genolapio sudarymu ir baigiasi pilnu genomo sekvenavimu

  • Funkcinė genomika tiria, kaip genų sąveikos skuria organizmo požymius

  • Funcinės genomikos pagrindinė paskirtis yra išsiaiškinti genetinių sekų reikšmę organizmo funkcionavimui

    • Daugeliu atvejų tai leidžia suprasti geno funkciją


Pilnas rinkinys baltymų, kuriuos gali sintetinti organizmas, yra vadinamas proteomu

  • Pilnas rinkinys baltymų, kuriuos gali sintetinti organizmas, yra vadinamas proteomu

  • Proteomika yra visų genomo koduojamų baltymų ir jų sąveikų tyrimas

  • Proteomikos tikslas yra išsiaiškinti organizmo baltymų funkcinę paskirtį

    • Taip pat ji siekia ištirti baltymų sąveikas
  • Bioinformatikos tikslas yra perskaityti informaciją, esančią genetinėse sekose, naudojant matematinius/kompiuterinius metodus



10.1 STRUKTŪRINĖ GENOMIKA

  • DNR sričių struktūrinė organizacija paprastai nustatoma trimis būdais

  • 1. Citogenetinis (geno)kartografavimas

    • Remiasi mikroskopine analize
    • Genai siejami su chromosomų ruožais
  • 2. Sankibos (geno)kartografavimas

    • Remiasi kryžminimais
    • Nustatoma genų padėtis vienas kito atžvilgiu
      • Atstumai matuojami genolapio vienetais (arba centimorganais)
  • 3. Fizinis (geno)kartografavimas

    • Remiasi DNR klonavimo metodais
    • Nustatoma genų padėtis vienas kito atžvilgiu
      • Atstumai matuojami bazių poromis


Citogenetinis (geno)kartografavimas

  • Citogenetinis kartografavimas remiasi mikroskopija

    • Dažniausiai naudojamas tiriant eukariotus, turinčius dideles chromosomas
  • Eukariotų chromosomas galima atskirti pagal

    • Dydį
    • Centromeros padėtį
    • Ruožuotumą
  • Ruožuotumas išryškėja chromosomas nudažius specifiniais dažais

    • Jis naudojamas genų kartografavimui


Darant citogenetinį kartografavimą yra bandoma nustatyti genų išsidėstymą specifinių chromosomos ruožų atžvilgiu

  • Darant citogenetinį kartografavimą yra bandoma nustatyti genų išsidėstymą specifinių chromosomos ruožų atžvilgiu

    • Dažniausiai tai yra augalų ir gyvūnų genų lokalizacijos nustatymo pirmasis etapas
  • Citogenetinis kartografavimas remiasi mikroskopija

    • Todėl jo skiriamoji geba yra gana limituota
      • Daugelio rūšių atveju ji yra ~ 5 milijonus bp
    • Skiriamoji geba daug geresnė toms rūšims, kurios turi politenines chromosomas
      • Pvz., Drosophila melanogaster


Hibridizacija in situ

  • Hibridizacija in situ padeda nustatyti geno padėtį intaktinėse chromosomose

    • Ji naudojama nustatyti genų ar DNR sekų lokalizaciją didelėse eukariotų chromosomose
  • Naudojami zondai, padedantys aptikti ieškomas DNR sekas (“taikinį”)

  • Dažniausiai naudojami fluorescenciniais dažais pažymėti DNR zondai

    • Šis metodas vadinamas fluorescencine in situ hibridizacija (FISH)




Fluorescencinių zondų skleidžiamai šviesai aptikti yra naudojami fluorescenciniai mikroskopai

  • Fluorescencinių zondų skleidžiamai šviesai aptikti yra naudojami fluorescenciniai mikroskopai

    • Fluorescuojantis zondas yra matomas kaip švytinti sritis nešvytinčiame fone
      • Zondai prisitvirtina tik prie specifinių sekų
  • FISH eksperimentų rezultatai yra lyginami su Giemsa dažais nudažytų chromosomų vaizdu

    • Zondo padėtis gali būti nusakoma G ruožų atžvilgiu






Sankibos (geno)kartografavimas

  • Sankibos kartografavimas remiasi rekombinantinių palikuonių dažnio skaičiavimu

    • Visi genai, esantys vienoje chromosomoje, yra paveldmi kartu sukibę, t.y. sudaro vieną sankibos grupę
    • Jei įvyksta krosingoveris, gali pasikeisti sukibusių genų seka
    • Krosingoverio dažnis tuo mažesnis, kuo arčiau vienas kito yra sukibę genai
  • Gali būti sudaromi ne genų, o genetinių žymenų genolapiai. Molekulinis žymuo yra DNR fragmentas, kuris randamas specifinėje chromosomos vietoje ir gali būti specifiškai atpažintas

    • Kaip ir alelių atveju, molekulinių žymenų ypatybės gali skirtis tarp skirtingų individų


Restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas (RFLP)

  • Restrikcijos fermentai atpažįsta specifines DNR sekas ir jose kerpa DNR

  • Ilgose chromosomose gali būti daug vietų, kurias atpažįsta ir kerpa restrikcijos fermentai

    • Jos yra pasiskirstę atsitiktinai
    • Lyginant du individus galima aptikti tokių atpažinimo vietų kiekio ir/ar išsidėstymo skirtumus












RFLP genolapiai

  • RFLP sankibos analizė gali būti atlikta su daugeliu RFLP žymenų, nustatant jų santykinę padėtį genome

  • Genolapis, sudarytas iš daugelio RFLP žymenų, vadinamas RFLP genolapiu

    • RFLP genolapiai naudojami genų padėčiai nustatyti tam tikroje chromosomoje




Fizinis (geno)kartografavimas

  • Fiziniam kartografavimui atlikti reikia klonuoti daugelį chromosominės DNR fragmentų

    • Klonuoti DNR fragmentai yra apibūdinami pagal
      • 1. Dydį
      • 2. Turimus genus
      • 3. Padėtį chromosomoje
  • Pastaraisiais metais naudojant fizinį kartografavimą sekvenuoti ištisi genomai





10.2 FUNKCINĖ GENOMIKA

  • Atliekamas plataus masto genomų sekvenavimas leidžia tyrinėti genų veiklą daug sudėtingesniame lygmenyje

    • Dabar galima vienu metu tirti daugelio genų grupių veiklą
  • Vienas iš pagrindinių genominių tyrimų tikslų yra nustatyti tas DNR sritis, kuriose iš tiesų yra genų

    • Vienas būdų tai padaryti yra parodyti, kad tiriama sritis yra transkribuojama į RNR


Genų ekspresija gali būti nustatyta cDNR bibliotekoje

  • Tai padaroma sukuriant cDNA biblioteką

    • cDNR (copy DNA) yra gaunama atvirkštinės transkriptazės pagalba susintetinus DNR nuo mRNR, išskirtos iš ląstelės
    • cDNR biblioteka taip pat vadinama EST biblioteka (expressed sequence tag library)
      • Šios sekos taip pat gali būti naudojamos kaip žymenys, atliekant fizinį chromosomų kartografimą
  • EST bibliotekoje esančios sekos gali būti sekvenuotos ir vėliau palygintos su genomo sekomis

    • Atitikimai rodo, kurios genomo vietos koduoja genus
  • cDNR bibliotekos sukūrimas padeda tirti genų reguliaciją genomo lygmenyje

    • Tokių tyrimų strategija yra išskirti mRNR esant skirtingoms ląstelės ar organizmo funkcionavimo sąlygoms


Mikrogardelės gali nustatyti transkribuojamus genus

  • Sukurtas naujas tyrimo metodas, vadinamas DNR mikrogardelėmis (taip pat vadinama genų lustais)

    • Šis naujas metodas leidžia vienu metu tirti tūkstančių genų veiklą
  • DNR mikrogardelė yra maža silicio, stilo ar plastiko plokštelė, padengta daugelio DNR sekų taškeliais

    • Kiekviena iš šių sekų atitinka vieną žinomą geną
      • Šios sekos veikia kaip zondai, aptinkantys transkribuojamus genus


Šie DNR fragmentai gali būti

  • Šie DNR fragmentai gali būti

    • Amplifkuoti PGR pagalba ir vėliau pritvirtinti ant mikrogardelės
    • Tiesiogiai susintetinti ant mikrogardelės
    • Viena mikrogardelė turi dešimtis tūkstančių skirtingų taškų, o jos dydis neviršia pašto ženklo
      • Kiekvieno taško (su skirtingo geno DNR) padėtis gardelėje yra tiksliai žinoma
  • DNR mikrogradelių gamybos technologija yra gana įdomi ir primena technologiją, kuri naudojama rašaliniuose spausdintuvuose

  • Pagamintos DNR mikrogardelės naudojamos hibridizacijai su cDNR, susintetinta atvirkštinės transkriptazės pagalba nuo iš ląstelės išskirtų mRNR







DNR mikrogardelių panaudojimas



10.3 PROTEOMIKA

  • Proteomika tiria organizmo gaminamų baltymų funkcinę paskirtį

    • Pilnas rūšies baltymų rinkinys yra vadinamas proteomu
  • Genomikos duomenys gali suteikti svarbių žinių apie proteomą

    • 1. DNR mikrogardelės parodo genus, kurie yra transkribuojami esant tam tikroms sąlygoms
    • 2. Skirtingų rūšių genų homologijos tyrimai gali būti panaudojami baltymų struktūrai ar funkcijai nuspėti
  • Tačiau genominius tyrimus turi sekti tiesioginiai pačių baltymų tyrimai



Proteomas yra žymiai didesnis už genomą

  • Viso genomo sekvenavimas ir analizė gali padėti nustatyti visus rūšies genus

  • Tačiau proteomas yra didesnis už genomą ir tikrąjį jo dydį sunku nustatyti

    • Taip įvyksta dėl keletos procesų
      • 1. Alternatyvaus splaisingo
      • 2. RNR redagavimo
      • 3. Potransliacinės kovalentinės modifikacijos


1. Alternatyvus splaisingas

  • 1. Alternatyvus splaisingas

    • Svarbiausias pokytis, atsiradęs eukariotuose
    • Viena pre-mRNR yra pertvarkoma į keletą skirtingų mRNR
    • Splaisingas dažnai yra specifiškas tam tikroms ląstelėms arba tam tikroms aplinkos sąlygoms
  • 2. RNR redagavimas

    • Sutinkamas rečiau už alternatyvų splaisingą
    • Pakeičia koduojančią mRNR seką
  • 3. Potransliacinė kovalentinė modifikacija

    • Funkcionaliam baltymui sukurti gali būti reikalingos negrįžtamos modifikacijos
      • Proteolitinis procesingas; prostetinių grupių, cukrų ar lipidų prisijungimas
    • Grįžtami pokyčiai gali trumpam pakeisti baltymo funkcijas
      • Fosforilinimas; metilinimas
  • Visi šie procesai padidina potencialių baltymų kiekį proteome



Baltymų mikrogardelės

  • Yra kuriamos ir baltymų mikrogardelės

  • Baltymų mikrogardelių kūrimas yra sudėtingesnis procesas

    • 1. Baltymus žymiai lengviau pažeisti, atliekant įvairias manipuliacijas, reikalingas mikrogardelei pagaminti
    • 2. Baltymų sintezė ir išgryninimas reikalauja daug daugiau laiko, lyginant su DNR
  • Nepaisant to, pastaraisiais metais yra pasiektas tam tikras progresas baltymų mikrogardelių kūrime ir panaudojime proteomikos tyrimuose



Baltymų mikrogardelių panaudojimas



Yra du pagrindiniai baltymų mikrogardelių tipai

  • Yra du pagrindiniai baltymų mikrogardelių tipai

    • 1. Antikūnų mikrogardelės
    • 2. Funkcinės mikrogardelės
  • Antikūnų mikrogardelės

    • Sudarytos iš rinkinio antikūnų, atpažįstančių trumpas peptidų sekas
    • Naudojamos įvertinti baltymų ekspresijos laipsniui
  • Funkcinės mikrogardelės

    • Sudarytos iš daugelio skirtingų ląstelės baltymų
    • Naudojamos baltymų funkcijoms tirti


10.4 BIOINFORMATIKA

  • Kompiuteris tapo svarbiu genetinių tyrimų instrumentu

    • Genetikos ir informatikos mokslų sandūroje susikūrė nauja mokslo šaka - bioinformatika
  • Genetinių sekų kompiuterinei analizei paprastai reikia trijų pagrindinių elementų:

    • Kompiuterio
    • Kompiuterinių programų
    • Genetinių duomenų


Sekos analizuojamos naudojant kompiuterines programas

  • Kompiuterinė programa yra apibrėžta operacijų seka, kuri gali analizuoti duomenis pasirinktu būdu

  • Pirmasis kompiuterinės genetinių duomenų analizės etapas yra kompiuterinių duomenų bylos sukūrimas

    • Ši byla yra informacijos rinkinys, tinkamas saugoti ir manipuliuoti kompiuteryje
    • Pavyzdžiui, bylą gali sudaryti lacY geno iš E. coli DNR seka




Duomenų suvedimas į kompiuterį atliekamas

  • Duomenų suvedimas į kompiuterį atliekamas

    • Rankiniu būdu
    • Automatizuotai (tiesiogiai iš sekvenavimo įrenginio)
  • Genetinės sekos, esančios kompiuterinėse bylose, gali būti analizuojamos daugeliu būdų

    • Pavyzdžiui, gali būti ieškoma atsakymų į šiuos klausimus
      • 1. Ar sekoje yra genų?
      • 2. Ar genai turi reguliuojančias sekas (promotorius, splaisingo vietas ir kt.)?
      • 3. Ar seka koduoja polipeptidą?
        • Jei taip,tai kokia šio polipeptido seka?
      • 4. Ar seka yra homologinė kuriai nors kitai sekai?
      • 5. Koks yra evoliucinis ryšys tarp dviejų ar daugiau genetinių sekų?


Kompiuterinės duomenų bazės

  • Genetinės informacijos kiekis, nustatomas mokslininkų, yra itin didelis

  • Ši informacija kompiuterinių bylų pavidalu yra kaupiama genetinių duomenų bazėse

    • Bylos tokiose duomenų bazėse dažniausiai yra anotuotos
      • Jose yra genetinė seka ir detalus jos aprašymas
      • Be to, pateikiamos kitos svarbios sekų ypatybės
  • Pasaulyje egzistuoja keletas didelių genetinių duomenų bazių, turinčių duomenis iš tūkstančių laboratorijų



Pagrindinės genetinių duomenų bazės



Kompiuterinės duomenų bazės

  • Anksčiau paminėtos genetinių duomenų bazės kaupia informaciją apie daugelį skirtingų biologinių rūšių

  • Taip pat yra kuriamos genomo duomenų bazės

    • Tai yra specializuotos duomenų bazės, kuriose kaupiami duomenys apie atskiras rūšis
    • Jų pagrindinis tikslas yra susisteminti sekvenavimo ir kartografavimo rezultatus
    • Genomo duomenų bazėse taip pat yra duomenų apie alelius, tyrimus atliekančius mokslininkus ir bibliografinės rodyklės


Skirtingos analizės strategijos

  • Kompiuterinės programos gali aptinkti reikšmingas vietas labai ilgose sekose

  • Jų veikimo principas gali būti pademonstruotas 54 raidžių sekos pavyzdžiu:



Pirmoji programa gali nustatyti visus anglų kalbos žodžius, esančios šioje sekoje:

  • Pirmoji programa gali nustatyti visus anglų kalbos žodžius, esančios šioje sekoje:



Taigi, kompiuterių programos atpažįsta arba sekas, arba struktūras

  • Taigi, kompiuterių programos atpažįsta arba sekas, arba struktūras

  • Sekų atpažinimas

    • Programa turi informacijos, kad specifinė seka ar simboliai turi specializuotą reikšmę
      • Turėdama šią informaciją, pirmoji programa gali nustatyti sekas ar raides, kurios sudaro žodžius
  • Struktūrų atpažinimas

    • Nėra paremtas specifinių sekų turimos informacijos atpažinimu
      • Šio tipo programos (pvz., pavyzdžio trečioji programa) ieško tam tikrų dėsningų struktūrų, kurios gali būti bet kurioje sekoje ar sekų grupėje


Anksčiau paminėtos programos iliustruoja pagrindines sekų identifikavimo strategijas:

  • Anksčiau paminėtos programos iliustruoja pagrindines sekų identifikavimo strategijas:

    • 1. Nustatomos prasmingos specializuotos sekos (sekų elementai), esančios labai ilgoje genetinėje sekoje
      • Kurie sekų elementai prasmingi, yra nustatyta pačioje programoje
      • Pavyzdys yra pirmoji programa
    • 2. Nustatoma sekų ar jų elementų organizacija
      • Pavyzdys yra antroji programa
    • 3. Nustatoma sekų struktūra
      • Pavyzdys yra trečioji programa


Genetinė seka, turinti tam tikrą funkciją, yra vadinama sekos elementu arba sekos motyvu

  • Genetinė seka, turinti tam tikrą funkciją, yra vadinama sekos elementu arba sekos motyvu

  • Taip pat aptikti specifiniai aminorūgščių motyvai, atliekantys baltymuose specializuotas funkcijas

    • Pvz., asparaginas–X–serinas (kur X yra bet kuri aminorūgštis) yra eukariotų baltymų glikozilinimo vieta
    • Prosite duomenų bazėje yra kaupiamos žinios apie aminorūgščių motyvus, turinčius funkcinę reikšmę
      • Tokia duomenų bazė padeda greičiau išsiaiškinti naujai aptiktų baltymų funkcijas


Trumpi sekų elementai, nustatomi kompiuterinės analizės metu



Struktūrinių genų nustatymas

  • Genų nustatymui kompiuterinės programos gali naudoti skirtingas strategijas:

    • Paieška pagal signalą
      • Programa bando nustatyti žinomų sekų elementų, dažniausiai randamų genuose, išsidėstymą tiriamoje sekoje
        • Promotoriai, starto/stop kodonai
    • Paieška pagal turinį
      • Programa stengiasi nustatyti sekas, kurių nukleotidų sudėtis skiriasi nuo atsitiktinio pasiskirstymo
        • Tai daroma todėl, kad struktūriniuose genuose kodonai naudojami neatsitiktinai


Kitas būdas nustatyti koduojančias sritis yra analizuoti transliuojamus skaitymo rėmelius

  • Kitas būdas nustatyti koduojančias sritis yra analizuoti transliuojamus skaitymo rėmelius

  • DNR sekoje kodonų nuskaitymas gali prasidėti nuo pirmojo, antrojo arba trečiojo nukleotido

    • Tai 1, 2 ir 3-as skaitymo rėmeliai
  • Atviras skaitymo rėmelis (open reading frame - ORF) yra nukleotidų seka, neturinti stop kodonų

    • Prokariotams būdingi ilgi atviri skaitymo rėmeliai
    • Eukariotų koduojančios sekos gali būti pertrauktos intronų


Kompiuterinė programa gali nustatyti visus atvirus skaitymo rėmelius genominėje DNR sekoje, ieškodama ilgo ASR

  • Kompiuterinė programa gali nustatyti visus atvirus skaitymo rėmelius genominėje DNR sekoje, ieškodama ilgo ASR



Kompiuterinės programos gali nustatyti homologines sekas

  • DNR sekvenavimo duomenys leidžia tirti evoliucinius ryšius molekuliniame lygmenyje

    • Tokie tyrimai tapo galingu genomikos tyrimų metodu
  • Lyginant genetines sekas, kartais galima aptikti dvi ar daugiau panašių sekų



lacY geno DNR sekos

  • lacY geno DNR sekos

    • ~ 78% bazių sutampa
  • Šiu atveju sekos panašios, nes du tiriami genai yra homologiški

    • Jie išsivystė iš to paties protėvinio geno




Kai du homologiniai genai yra randami skirtingose rūšyse, jie yra vadinami ortologais

  • Kai du homologiniai genai yra randami skirtingose rūšyse, jie yra vadinami ortologais

  • Kai du homologiniai genai randami tame pačiame organizme, jie yra vadinami paralogais

    • Genų šeima, sudaryta iš dviejų ar daugiau homologinių genų kopijų, esančių to paties organizmo genome
  • Svarbu nepainioti sąvokų homologija ir panašumas

    • Homologija nurodo bendrą kilmę
    • Panašumas reiškia didelį sekų sutapimo laipsnį
    • Daugeliu atveju panašumas yra dėl homologijos
      • Tačiau taip yra ne visada


Tiriant genų sekas galima nusakyti RNR ir baltymų struktūrą

  • Makromolekulių, tokių kaip DNR, RNR ir baltymai, funkcijos priklauso nuo jų struktūros

    • Jų erdvinė struktūra iš tiesų priklauso nuo juos sudarančių elementų linijinio išsidėstymo
  • Dabartiniu metu erdvinė makromolekulių struktūra tyrinėjama naudojant pagrindinai biofizikinius metodus

    • Pvz., rentgenokristalografiją ir BMR
    • Šie metodai yra techniškai sudėtingi ir reikalauja daug laiko
    • DNR sekvenavimas yra žymiai paprastesnis


RNR molekulės paprastai sudaro antrines struktūras, turinčias dvigrandinines sritis

  • RNR molekulės paprastai sudaro antrines struktūras, turinčias dvigrandinines sritis

    • Šios struktūros yra toliau lankstomos ir pakuojamos, susidarant tretinėms struktūroms
  • Genetikus šios struktūros domina, nes nuo jų priklauso molekulių funkcijos

  • Todėl RNR struktūrų kompiuterinis modeliavimas yra svarbus tokių tyrimų instrumentas





Struktūros nustatymas taip pat naudojamas ir proteomikoje

  • Struktūros nustatymas taip pat naudojamas ir proteomikoje

  • Pasikartojantys baltymų struktūriniai elementai yra  spiralės ir  klostės

  • Keletas kompiuterinių programų yra naudojamos antrinei baltymų struktūrai nustatyti, remiantis pirmine jų struktūra

    • Šios programos remiasi keletu skirtingų parametrų
      • Dažniausiai yra naudojami aminorūgščių statistiniai dažniai, nustatyti tiriant tas antrines struktūras, kurios buvo kristalizuotos
        • Baltymų antrinės struktūros kompiuterinio nustatymo tikslumas siekia 60-70%


Yüklə 461 b.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə