АМЕА-nın Xəbərləri (biologiya və tibb elmləri), cild 69, №2, səh. 5-13 (2014)
5
Quraqlıq Stresinin Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin (Hordeum
vulgare L.) Yarpaqlarında Antioksidant Fermentlərin Fəallığının və İzoenzim
Tərkibinin Tədqiqi
İ.M. Hüseynova
1*
, M.Y. Nəsrullayeva
2
, S.M. Rüstəmova
1
, D.R. Əliyeva
1
, C.Ə. Əliyev
1
1
AMEA Botanika İnstitutu, Badamdar şossesi, 40, Bakı AZ 1073, Azərbaycan;
2
AMEA Genetik Ehtiyatlar İnstitutu, Azadlıq prospekti, 155, Bakı AZ 1106, Azərbaycan;
*E-mail: huseynova-i@botany-az.org
Quraqlıq bütün dünyada bitkilərin məhsuldarlığını və dənin keyfiyyətini aşağı salan əsas stres
amillərindən biridir. Arpa bitkisi zəngin genetik müxtəlifliyə malik olub ətraf mühitin əlverişsiz
amillərinə qarşı kontrast genotiplərin cavab reaksiyalarını qiymətləndirmək üçün mühüm mənbədir.
Antioksidant metabolizm bitkilərin quraqlığa cavab reaksiyalarında əhəmiyyətli rol oynaya bilir.
Tədqim olunan işin məqsədi quraqlıq stresi zamanı antioksidant fermentlər səviyyəsində aşkar olunan
fərqlər əsasında arpa genotiplərinin quraqlığa davamlılıq variasiyalarının müəyyən edilməsi
olmuşdur. Torpaq quraqlığına məruz qalmış 4 arpa genotipinin yarpaqlarında katalaza (KAT),
askorbatperoksidaza (APO), qlütation-reduktaza (QR) və superoksiddismutaza (SOD) fermentlərinin
fəallıqları və izoenzim tərkibləri öyrənilmişdir. Quraqlığa məruz qalmış bitkilərdə KAT və SOD-un
fəallıqları artmış, APO-nun fəallığı isə azalmışdır. Kəskin quraqlıq şəraitində QR-in ümumi fəallığı К
2778 və St. Qarabağ 7 genotiplərində artmış, yerli №77 və St.Pallidum 596 genotiplərində isə
azalmışdır. Normal suvarma şəraitində becərilən nümunələrlə müqayisədə stres zamanı fermentlərin
izoenzim tərkibində əsaslı fərqlər (yeni izoformaların əmələ gəlməsi və yaxud itməsi) müşahidə
edilməmiş, lakin elektroforetik spektrlərdə uyğun izoformaların intensivliyi artmışdır.
Açar sözlər: Hordeum vulgare L., quraqlıq stresi, oksigenin aktiv formaları, antioksidant fermentlər,
izoenzim tərkibi
GİRİŞ
Digər dənli bitkilərlə müqayisədə, arpa dən və
samanının keyfiyyəti baxımından yem bitkisi kimi
daha dəyərlidir. Bütün dünyada kənd təsərrüfatı
bitkilərinin məhsuldarlığını və dənin keyfiyyətini
aşağı salan əsas stres amillərindən biri quraqlıqdır
(Aranjuelo et al., 2011; Li et al., 2013). İqlim
dəyişikilikləri üzrə fəaliyyət göstərən müxtəlif
Dövlətlərarası Qrupların ekspertləri tərəfindən irəli
sürülən proqnozlara əsasən, gələcəkdə yağıntıların
daha da azalması və nəticədə evapotranspirasiya
proseslərinin güclənməsi gözlənilir (Solomon et al.,
2007). Məlumdur ki, bitki orqanizmində su qıtlığı
kimi stres amilin təsirindən baş verən oksidləşdirici
proseslər nəticəsində oksigenin fəal formaları (OFF)
olan superoksid (O
2
•
), hidrogen peroksid (H
2
O
2
),
hidroksil radikalları (ОН
•
) və atomar oksigenin (
1
О
2
)
miqdarı sürətlə artır (Faize et al., 2011). Hüceyrədə
OFF ilə antioksidant fermentlər arasında mövcud
balansın pozulması bir sıra oksidləşdirici
zədələnmələrin əmələ gəlməsinə zəmin yaradır. OFF
olduqca yüksək aktivliyə malikdir və onların artıq
miqdarı membran lipidləri, zülallar və nuklein
turşularına əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərərək
ciddi zədələnmələrə gətirib çıxarır (Apel and Hirt,
2004). Bitkilər OFF-larıının zədələyici təsirini
aradan qaldıra biləcək güclü antioksidant sistemə
malikdirlər (Joseph and Jini, 2011). Bitki
orqanizmində yaranan OFF-ların toksiki təsirinə
qarşı
fəaliyyət göstərən fermentativ
(superoksiddismutaza, katalaza, askorbat-peroksida-
za, qlütationreduktaza və s.) və qeyri-fermentativ
(askorbin turşusu, tokoferol, qlutation, fenol birləş-
mələri və s.) antioksidant sistemlər mövcuddur. Bir
qayda olaraq, hər hüceyrə kompartmenti konkret
OFF-ni zərərsizləşdirə bilən bir və ya bir neçə
fermentativ fəallığa malikdir. Antioksidant ferment-
lər praktiki olaraq hüceyrənin bütün kompartmentlə-
rində OFF-ini detoksikasiya edərək, bitkinin müdafiə
sistemində əhəmiyyətli rol oynayır (Mittler, 2002;
Ahmad et al., 2010).
Son on il ərzində bitki orqanizminin oksidləş-
dirici stresə qarşı cavab reaksiyalarının molekulyar-
genetik mexanizmləri daha dərin şəkildə öyrənil-
mişdir. Müəyyən edilmişdir ki, bitkilərdə 150-dən
artıq gen OFF-in detoksikasiyasında iştirak edən
fermentlərin sintezini kodlaşdıraraq yüksək təşkil
olunmuş OFF gen şəbəkəsini əmələ gətirir (Mittler
et al., 2004). Bitkilərin antioksidant müdafiə sis-
temlərini kodlaşdıran bəzi genlər artıq klonlaşdırıla-
raq, transgen xətlərin alınmasında istifadə olunur
(Sarovar et al., 2005). Ətraf mühitin əlverişsiz stres
amillərinə qarşı yüksək davamlılığın əldə olunma-
Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin
6
sında hüceyrədə əsas funksiyalara cavabdeh olan,
yəni hüceyrə komponentlərinin quruluşunu saxlaya
bilən genlərlə aparılan manipulyasiyalar böyük
əhəmiyyət kəsb edir.
Bu istiqamətdə müasir ədəbiyyat məlumatlarının
təhlili göstərmişdir ki, stres amillərinə qarşı ümumi
cavab reaksiyası mövcud deyildir (Fayez and Bazaid,
2014; Amini, 2013; Faize et al., 2011; Ashraf, 2010).
Antioksidant sistemin eyni bir stres amilinə qarşı
cavab reaksiyası bitkinin növündən, onun yaşı və be-
cərilmə şəraitindən asılıdır (Polesskaya, 2007). Eyni
zamanda antioksidant sistemin cavab reaksiyası stre-
sin müddəti ilə də müəyyən edilir (Aranjuelo et al.,
2011; Ashraf, 2010; Fu and Huang, 2001).
Antioksidant sistemin oksidləşdirici stresə qarşı cavab
reaksiyası bitkinin fizioloji vəziyyəti ilə determinə
olunan fermentlərin fəallığından da asılıdır (Shao et
al., 2005).
Yuxarıda qeyd olunanları nəzərə alaraq, təqdim
olunan işin əsas məqsədi torpaqda su qıtlığı şəraitin-
də yetişdirilən müxtəlif arpa genotiplərində antioksi-
dant fermentlərdən katalaza, askorbat peroksidaza,
qlütation reduktaza və superoksiddismutazanın fəal-
lıqlarının və izoferment tərkibinin tədqiqi olmuşdur.
MATERİAL VƏ METODLAR
Tədqiqat obyekti kimi, Nutans növ müxtəlifli-
yinə aid St.Qarabağ-7 və № 77 yerli, Pallidum növ
müxtəlifliyinə aid Pallidum-596 və K-2778
genotipləri götürülmüşdür. Bitkilər Azərbaycan
Elmi-Tədqiqat Əkinçilik İnstitutunun Cəlilabad
Bölgə Təcrübə Stansiyasında normal suvarma və su
qıtlığı şəraitində becərilmişdir.
Katalaza fermentinin fəallığının təyini
Katalazanın (KAT) fəallığının təyini üçün 1 q
yarpaq toxuması 10 ml 50 mM kalium-fosfat
buferində (pH 7.0) əzilmişdir. Homogenat filtrasiya
edilmiş və 10 dəqiqə ərzində 8000 g-də
sentrifuqalaşdırılmışdır. 2,9 ml fosfat buferinin (pH
7,0) üzərinə 25 mkl alınmış ferment ekstraktı
tökülmüşdür. Ölçmədən qabaq bu məhlula 90 mkl 3
%-li H
2
O
2
əlavə edilmişdir. Spektrofotometrdə 1
dəqiqə ərzində 240 nm dalğa uzunluğunda optik
sıxlığın düşməsi ölçülmüşdür. Fermentin fəallığı
molyar ekstinksiya əmsalı ε=39,4 mM
-1
sm
-1
əsasında mmol/(q·dəq) vahidində hesablanmışdır
(Kumar and Knowles, 1993).
Askorbatperoksidaza fermentinin fəallığının təyini
Askorbatperoksidazanın (APO) fəallığını təyin
etmək üçün 1 q yarpaq götürülmüş və soyuqda 10 ml
50 mM kalium-fosfat buferində (pH 7,6) əzilmişdir.
0,3 q PVP əlavə edildikdən sonra süzülmüş və 10 də-
qiqə ərzində 12000 g-də sentrifuqalaşdırılmışdır. Re-
aksiya qarışığının tərkibində 50 mkM 0,1 mM H
2
O
2
,
2,55 ml 50 mM fosfat buferi (pH 7,6) və homogenatı
sentrifuqalaşdırdıqdan sonra alınan bitki ekstraktından
300 mkl götürülmüşdür. Optik sıxlıq ULTROSPEC
3300 PRO (“AMERSHAM”, ABŞ) spektrofotome-
trində, nəzarət kimi fermentsiz ekstrakt götürülərək
290 nm dalğa uzunluğunda ölçülmüşdür. APO-nun
fəallıq ölçüsü kimi reaksiyanın ilk 30 saniyəsində op-
tik sıxlığın düşməsi götürülmüş və molyar ekstinksiya
əmsalı kimi ε=2,8 mM
-1
sm
-1
nəzərə alınaraq,
mmol/q·dəq vahidində hesablanmışdır (Nakano and
Asada, 1981).
Qlütation reduktaza fermentinin fəallığının təyini
Qlütation reduktazanın (QR) fəallığı
spektrofotometrik üsulla 340 nm dalğa
uzunluğunda oksidləşmiş qlütationun iştirakı ilə
NADFH-ın oksidləşməsi
əsasında müəyyən
edilmişdir (Yannarelli, 2007). Reaksiya mühitində
100 mM fosfat buferi (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,2
mM NADF H və 0,5 mM oksidləşmiş qlütation
olur. Optik sıxlıq 10 dəqiqə müddətində
ölçülmüşdür. Fermentin aktivliyi mkmol/(mq dəq)
ilə ölçülür, əsas molyar ekstinksiya əmsalı ε=6,2
mM
-1
sm
-1
götürülmüşdür (Yannarelli, 2007).
Superoksiddismutaza fermentinin fəallığının
təyini
Superoksiddismutazanın (SOD) fəallığını təyin
etmək üçün spesifik kitdən (SOD Assay Kit-WST,
Sigma-Aldrich) istifadə olunmuşdur. Bitki hüceyrə-
lərində SOD-un bir neçə izoforması mövcuddur. Fer-
mentin sitozol forması tədqiq edilmişdir. Çəkilmiş
yarpaqlar 50 mM kalium-fosfat buferində (pH 7,8)
homogenləşdirilmişdir. Homogenat sentrifuqalaşdırıl-
mış, supernatantdan SOD-un sitozol formasını özün-
də saxlayan qarışıq kimi istifadə olunmuşdur. Optik
sıxlıq 450 nm dalğa uzunluğunda təyin edilmişdir .
Zülalların miqdarının təyini
Zülalların miqdarı Sedmak metoduna
əsaslanaraq, Kumasi-G250 rəngləyicisindən və
qliserindən istifadə etməklə (1:1) təyin edilmişdir
(Sedmak and Grossberg, 1977).
Fermentlərinin keyfiyyət tərkibinin elektroforetik
təyini
Askorbatperoksidaza və katalazanın aktivlik-
lərinin keyfiyyət dəyişkənliyi Lemmli metoduna
əsasən (Laemmli, 1970) nativ poliakrilamid gel
Hüseynova və b.
7
(PAAG) elektroforez üsulu ilə öyrənilmişdir.
Zülalların miqdarı Sedmak metoduna əsasən
(Sedmak and Grossberg, 1977) müəyyən olunmuş,
standart zülal kimi öküzün zərdab albuminindən
istifadə edilmişdir. Elektroforez 0,75 mm qalınlığa,
8 sm hündürlüyə malik 7%-li (KAT üçün) və 10%-
li (APO üçün) PAAG-də Tris-HCl buferində (pH
8,3) 3 saat 4°C temperaturda 30 mA sabit
cərəyanda SE 250 (“Amersham Biosciences”,
ABŞ) cihazında aparılmışdır.
Askorbatperoksidazanın izoenzim tərkibi Mit-
tler və Zilinskas metoduna əsasən (Mittler and
Zilinskas, 1993) təyin edilmiş, elektrod buferinə 2
mM natrium askorbat əlavə edilmişdir. Elektrofo-
rezdən sonra gel tərkibində 2 mM Na-askorbat olan
50 mM kalium fosfat buferində (pH 7,0) 30 dəqiqə
inkubasiya olunur. Bundan sonra gel 20 dəqiqə tər-
kibində 4 mM Na-askorbat və 2 mM H
2
O
2
olan 50
mM kalium fosfat buferində (pH 7,0) saxlanılmış,
daha sonra tərkibində 28 mM TEMED və 2,45 mM
nitro tetrazolium mavisi olan 50 mM kalium fosfat
buferində (pH 7,8) ag fonda mavi xəttlər görünənə
qədər inkubasiya olunmuşdur.
Katalazanın izoenzim tərkibini təyin etmək üçün
gel 1% K
3
[Fe(CN)
6
], 1% FeCl
3
və 3,27 mM H
2
O
2
məhlulunda 20 dəqiqə qaranlıqda saxlandıqdan sonra
işığa keçirilir və tünd göy fonda sarı xəttlər görünənə
qədər inkubasiya olunmuşdur (Woodbury et al.,
1971).
NƏTİCƏLƏR VƏ ONLARIN MÜZAKİRƏSİ
Normal suvarma və quraqlıq şəraitlərində becə-
rilən arpa genotiplərinin antioksidant sisteminin fəal-
lığında əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilmişdir. Bit-
kilərin oksidləşdirici stresə qarşı müdafiə sistemində
əsas rol oynayan antioksidant fermentlərdən biri
katalazadır. Bu ferment hidrogen peroksidin sürətli
utilizasiyasını təmin edir (Mhamdi et al., 2010).
Buna görə də normal suvarma və quraqlıq stresi
zamanı Nutans növ müxtəlifliyinə aid St.Qarabağ-7
və № 77 Yerli və Pallidum növ müxtəlifliyinə aid
St.Pallidum 596 və K-2778 genotiplərində katalaza
fermentinin fəallığı təyin edilmişdir (Şəkil 1).
Normal suvarılan bitkilərdə katalazanın fəallığında
əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilməmişdir.
St.Qarabağ-7 genotipində digər genotiplərlə
müqayisədə katalazanın fəallığı bir qədər yüksək
(140±12 mkMol/mq.dəq), Pallidum-596 genotipində
isə nisbətən aşağı olmuşdur (90±10 mkMol/mq·dəq).
№ 77 Yerli və K-2778 genotiplərində normal
suvarma zamanı katalazanın fəallığı demək olar ki,
eyni qiymətə malik olmuşdur.
Quraqlıq stresinin təsirinə məruz qalmış bütün
genotiplərdə KAT-ın fəallığı yüksək olmuşdur.
St.Qarabağ-7 genotipində normal suvarılan bitkilərlə
müqayisədə su qıtlığı zamanı katalazanın fəallığı 2
dəfəyədək artmış və 260±24 mkMol/mq.dəq təşkil
etmişdir. № 77 Yerli və K-2778 genotiplərində
normal suvarma zamanı olduğu kimi, quraqlığın
təsirindən katalazanın fəallığı, demək olar ki, eyni
səviyyədə yüksəlmişdir. Pallidum-596 genotipində
su qıtlığı zamanı KAT-ın fəallığı nisbətən az artmış
və 100±12 mkMol/mq·dəq təşkil etmişdir. Quraqlıq
zamanı katalazanın yüksək fəallığı onun stresə qarşı
müdafiə funksiyası rolunu göstərir. Katalaza
fermenti xromoproteidlərə aid olub, prostetik qrup
(qeyri-zülal) kimi oksidləşmiş hem saxlayır.
Mübadilə reaksiyaları zamanı əmələ gələn hidrogen-
peroksid müəyyən qatılıqlarda hüceyrə üçün toksiki
təsir göstərir. Katalaza fermenti hidrogen-peroksidi
zərərsizləşdirərək, onu suya və qeyri-aktiv
molekulyar oksigenə çevirir (Mittler, 2002).
0
50
100
150
200
250
300
St.Qarabağ 7
№ 77 Yerli
St.Pallidum 596
K-2778
KAT
-ı
n f
əal
lı
ğı
(
m
kM
ol/m
q
d
əq)
Kontrol
Stres
Şəkil 1. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində katalaza fermentinin fəallığı.
Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin
8
0
100
200
300
400
500
600
700
800
St.Qarabağ 7
№ 77 Yerli
St.Pallidum 596
K-2778
AP
O
-nun f
əall
ığ
ı (
m
kM
ol/m
q
də
q)
Kontrol
Stres
Şəkil 2. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində askorbatperoksidaza fermentinin fəallığı.
Canlı hüceyrələrdə katalaza fermenti ilə yana-
şı, hidrogen-peroksidi zərərsizləşdirən peroksidaza
fermenti də vardır. Lakin sübut olunmuşdur ki, ka-
talaza öz katalitik funksiyasını peroksidazadan asılı
olmayaraq yerinə yetirir. Peroksidlərin aşağı səviy-
yələrində öz funksiyasını yerinə yetirən peroksida-
zalardan fərqli olaraq, katalaza peroksidlərin
yüksək qatılıqlarında da effektiv təsir göstərir.
Bitkilərin oksidləşdirici stresdən müdafiəsində
askorbatperoksidaza fermenti də mühüm rol oynayır
(Najami et al., 2008; Sarvajeet and Narendra, 2010).
APO bitki hüceyrələrində xloroplastda və sitozolda
hidrogen peroksidin utilizasiyasında açar ferment
rolunu oynayır. Arpa genotiplərində askorbat-
peroksidaza fermentinin də fəallığı normal suvarma
və quraqlıq şəraitində analiz edilmişdir (Şəkil 2).
Normal suvarılma zamanı St.Qarabağ-7 genotipi
katalaza fermentinin maksimal fəallığı ilə xarakterizə
olunduğu halda, askorbatperoksidaza fermenti isə
əksinə, digər genotiplərlə müqayisədə minimal
fəallıq göstərir (280±22 mkMol/ mq·dəq). Ayrı-ayrı
növmüxtəlifliklərinə aid olmalarına baxmayaraq,
arpanın № 77 Yerli və K-2778 genotiplərində
askorbatperoksidaza fermentinin fəallığı, demək olar
ki, eynidir və uyğun olaraq № 77 Yerli üçün -
640±52 mkMol/mq·dəq, K-2778 genotipi üçün isə -
640±66 mkMol/mq·dəq təşkil edir. Maraqlıdır ki,
katalaza fermentinin də fəallığı bu genotiplərdə eyni
qiymətə malikdir. Arpanın St.Pallidum 596
genotipində normal suvarma zamanı
askorbatperoksidaza fermentinin maksimal fəallığı
müşahidə edildiyi halda (660±56 mkMol/mq·dəq),
KAT bu genotipdə minimal fəallıq götərmişdir.
Quraqlığın arpa genotiplərində askorbatperoksi-
daza fermentinin fəallığına təsiri şəkil 2-də göstəril-
mişdir. Şəkildən göründüyü kimi, katalaza fermentin-
dən fərqli olaraq, bütün genotiplərdə su qıtlığının
təsirindən askorbatperoksidazanın fəallığı aşağı düş-
müşdür. Bu zaman fermentin minimal fəallığı №St.
Qarabağ-7 genotipində (240±21 mkMol/ mq·dəq),
maksimal fəallıq isə K-2778 genotipində (360±33
mkMol/mq·dəq) müşahidə edilmişdir. Su qıtlığı şəra-
itində askorbat-peroksidaza fermentinin maksimal fə-
allığı ilə xarakterizə olunan K-2778 genotipində kon-
trola nəzərən fermentin fəallığı, təxminən 2 dəfəyə
qədər aşağı düşür. Stres zamanı arpanın № 77 Yerli
və St.Pallidum-596 genotiplərində askorbatperoksi-
daza fermentinin fəallığı eyni olmuşdur.
APO askorbatın oksidləşməsini kataliz edir və
monodehidroaskorbat (MDA) radikalının meydana
gəlməsinə gətirib çıxarır. APO-nun hüceyrə
daxilində kompartmentləşməsinə görə 4 müxtəlif
forması ayırd edilir: xloroplastlarda stromada həll
olmuş forma (sAPX), xloroplastlarda tilakoidlə
birləşmiş forma (tAPX), sitozol forma (cAPX) və
qlioksisomal membran forma (gmAPX). Quraqlıq
və istilik stresi zamanı APO-nun fəallığnın
dəyişməsi müxtəlif müəlliflər tərəfindən qeyd
olunmuşdur (Badiani et al., 1990). Eyni zamanda
hidrogen peroksidin APO-nun sitozol fraksiyasının
genini induksiyalaşdıraraq oksidləşdirici stresin
təsiri zamanı siqnalların ötürülməsində iştirakı da
məlumdur (Yoshimura et al., 2000).
Qlütationreduktaza bitkilərin antioksidant sis-
teminin müdafiəsində vacib ferment hesab edilir. O,
qlutation-askorbat tsiklində NADFH
+
-ın iştirakı ilə
oksidləşmiş qlutationun bərpasını kataliz edir
(Saruhan et al., 2009). Tədqiqat zamanı qlütation-
reduktaza fermentinin fəallığı da ölçülmüşdür
(Şəkil 3). Normal suvarılan bitkilər arasında № 77
Hüseynova və b.
9
genotipi QR-nın maksimal fəllığı (99±10 mkMol/
mq·dəq), K-2778 genotipi isə bu fermentin mini-
mal fəallığı (42±6 mkMol/mq·dəq) ilə xarakterizə
olunur. Normal suvarma şəraitində qlutation-reduk-
tazanın fəallığına görə aralıq yerləri St.Qarabağ-7
və St.Pallidum 596 genotipləri tutur.
Tədqiq edilən arpa genotiplərinin bir hissə-
sində su qıtlığının təsirindən qlütationreduktazanın
fəallığı artmış, digərlərində isə, əksinə, azalmışdır
(Şəkil 3). Su qıtlığı zamanı QR-in fəallığı üçün
maksimal göstərici St.Qarabağ-7 genotipində
(156±13 mkMol/mq·dəq), minimal göstərici isə
St.Pallidum 596 genotipində (15±2 mkMol/
mq·dəq) müşahidə edilmişdir. Quraqlıq şəraitində
QR-in fəallığına görə ikinci yerdə K-2778, növbəti
yerdə isə № 77 Yerli genotipi dayanır. Maraq do-
ğuran məqamlardan biri də odur ki, bu genotiplərdə
KAT üçün də eyni tendensiya müşahidə edilmişdir.
Amma stres və kontrol variantlarını öz aralarında
müqayisə etdikdə, bir qədər fərqli mənzərənin
şahidi oluruq. Belə ki, quraqlığın təsirindən QR-in
fəallığında normal suvarılan variantla müqayisədə
ən yüksək artım (3 dəfədən artıq) K-2778
genotipində müşahidə edilmişdir. St.Qarabağ-7
genotipində fermentin fəallığı, təxminən 2 dəfə
yüksəlmişdir. Digər iki genotipdə, quraqlığın
təsirindən qlütation-reduktazanın fəallığında azalma
müşahidə edilmişdir. Kontrol variantla müqayisədə
arpanın № 77 Yerli genotində QR-in fəallığı
stressin təsirindən az, St.Pallidum 596 genotipində
isə əhəmiyyətli dərəcədə (4 dəfə) aşağı düşmüşdür.
QR bitkilərdə 4 izoformaya malikdir və
müxtəlif hüceyrə kompartmentləri ilə assosiasiya
təşkil edir. Bu fermentin daha çox miqdarı
xloroplastlarla assosiasiyada olur, lakin sitozol və
mitoxondrilərdə də izozimlər aşkar edilmişdir
(Romero-Puertas et al., 2006; Saruhan et al., 2009).
Superoksid radikalının reduksiyası zamanı əmələ
gələn hidrogen-peroksid sitoplazma, xloroplast və
membranda askorbat-peroksidazanın iştirakı ilə
ayrılır. Bu zaman askorbatın oksidləşməsi baş verir:
2H
2
O
2
+ askorbat → dehidroaskorbat + H
2
O
2
+ O
2
.
Dehidroaskorbat reduksiya olunmuş qlutationun
(QSH) iştirakı ilə askorbat-reduktazanı əmələ gətirir:
2QSH + dehidroaskorbat → QSSQ + askorbat.
Oksidləşmiş qlutation (QSSQ) öz növbəsində
NADFH(H
+
) iştirakı ilə reduksiya olunmuş
qlutationa regenerasiya olunur: QSSQ + NADFH
+
H
+
→ 2QSH + NADFH
+
.
Superoksiddismutaza molekulyar oksigenin və
hidrogen-peroksidin əmələ gəlməsi ilə gedən
superoksid radikalının O
2
.-
dismutaza reaksiyasını
kataliz edir. SOD bitkilərin oksidləşdirici stresə qarşı
müdafiə sistemində ən vacib fermentlərdən biridir və
bitkilərin bütün hüceyrələrində rast gəlinir (Alscher
et al., 2002; Joseph and Jini, 2011).
Müxtəlif arpa genotiplərində superoksiddismu-
tazanın fəallığına su qıtlığının təsiri də tədqiq
olunmuşdur (Şəkil 4). Normal suvarılma zamanı №
77 Yerli və K-2778 genotiplərində superoksid-
dismutaza fermenti maksimal fəallıq göstərmişlər.
Bu şəraitdə fermentinin fəllığının minimal qiyməti
St.Pallidum 596 genotipində müşahidə edilmişdir
(82±9 fəallıq vahidi/mq zülal).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
St.Qarabağ 7
№ 77 Yerli
St.Pallidum 596
K-2778
GR
-n
ın f
əal
lı
ğı
(m
k
M
ol
/m
q
də
q)
Kontrol
Stres
Şəkil 3. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində qlütation-reduktaza fermentinin fəallığı.
Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin
10
0
20
40
60
80
100
120
St.Qarabağ 7
№ 77 Yerli
St.Pallidum 596
K-2778
SO
D
-u
n f
əal
lı
ğı
(f
əal
lı
q v
ah
idi
/m
q
zü
la
l)
Kontrol
Stres
Şəkil 4. Torpaq quraqlığı zamanı müxtəlif arpa genotiplərində superoksiddismutaza fermentinin fəallığı.
Şəkil 4-dən göründüyü kimi, tədqiq edilən arpa
genotiplərində su qıtlığının təsirindən superoksid-
dismutazanın fəallığı artmışdır. Stres şəraitində su-
peroksiddismutaza fermentinin fəallığı üçün maksi-
mal göstərici St.Qarabağ-7 genotipində (100±13
fəallıq vahidi/mq zülal), minimal göstərici isə
St.Pallidum 596 genotipində (93±8 fəallıq vahi-
di/mq zülal) müşahidə edilmişdir. Qeyd etmək ma-
raqlı olar ki, stres zamanı qlütation-reduktaza fer-
menti üçün də eyni tendensiya müşahidə edilmişdir.
Quraqlıq şəraitində superoksiddismutaza fermenti-
nin fəallığına görə ikinci yeri № 77 Yerli genotipi
tutur. Növbəti yer arpanın K-2778 genotipinə aid-
dir. Stres və kontrol variantlarını öz aralarında mü-
qayisə etdikdə, bir az fərqli mənzərə müşahidə
olunur. Belə ki, stresin təsirindən, superoksiddis-
mutazanın fəallığında ən yüksək artım St.Qarabağ-
7 genotipində müşahidə edilir. Bu genotipdə fer-
mentin fəallığı, normal suvarılan variantla müqayi-
sədə təxminən ~1,2 dəfə yüksəlmişdir.
Bir çox müəlliflər tərəfindən müxtəlif stres-
sorların təsiri zamanı SOD-un antioksidant müdafiə
sistemində əsas rol oynadığı göstərilir (Raychaudhuri,
2000; Alscher et al., 2002). Bununla yanaşı, SOD-un
su qıtlığına qarşı müxtəlif reaksiya göstərən müxtəlif
izoformaları var. Viqna bitkisində MnSOD və
FeSOD-un aktivliyi su qıtlığına cavab olaraq sürətlə
artır, bu zaman Cu/ZnSOD-un aktivliyi dəyişməz
qalır (Brou et al., 2007). Məlumdur ki, SOD fermenti
multimer metalloproteindir və bu fermentin aktiv
mərkəzində yerləşən metalın tipindən asılı olaraq
müxtəlif izoformaları vardır. Ədəbiyyat mənbələrinə
görə SOD-un ən geniş yayılmış izoforması aktiv
mərkəzində mis-sink (Cu/Zn-SOD), manqan (Mn-
SOD), dəmir (Fe-SOD) və nikel (Ni-SOD) saxlayan
formalardır (Faize et al., 2011). Bitki hüceyrələrində
müxtəlif stres amillərinə qarşı SOD-un induksiya
olunması onun bitkinin müdafiə sistemində əsas rol
oynadığını göstərir. Ümumiyyətlə, su qıtlığı zamanı
superoksid radikallarını utilizə etmək üçün SOD-un
fəallığı artır. Məlumdur ki, duzluluq şəratinində və
digər əlverişsiz mühit amillərinin təsiri zamanı bitkidə
yaranan oksidləşdirici stresə qarşı müxtəlif mexa-
nizimlər fəaliyyət göstərir. Oksigenin oksidləşməsi
SOD üçün substrat əmələ gətirməkdən əlavə, müxtəlif
mexanizmlərin işə düşməsinə səbəb olur.
Beləliklə, normal suvarma və su qıtlığı şərait-
lərində dörd müxtəlif arpa genotipində antioksidant
müdafiə sisteminin əsas fermentlərinin tədqiqi
nəticəsində aydın olmuşdur ki, quraqlıq stresinin
təsirindən katalaza və superoksiddismutaza fer-
mentlərinin fəallıqları tədqiq edilən arpa genotip-
lərində yüksəlmiş, askorbatperoksidaza fermentinin
fəallığı isə, əksinə, su qıtlığı zamanı azalmışdır.
Qlütationreduktaza fermentinin fəallığı quraqlıq
stresinə cavab olaraq, St.Qarabağ-7 və K-2778 ge-
notiplərində yüksəlmiş, № 77 Yerli və St.Pallidum
596 genotiplərində isə aşağı düşmüşdür.
Torpaq quraqlığı şəraitində arpa genotiplərində
antioksidant fermentlərin elektroforetik spektrləri də
tədqiq edilmişdir (Şəkil 5). Fermentlərin elektro-
foretik spektrlərində nəzərə çarpacaq keyfiyyət
fərqləri (elektroforeqramda əlavə xətlərin əmələ gəl-
məsi və ya itməsi) aşkar olunmamışdır. Lakin kon-
trol variantla müqayisədə stresə məruz qalmış arpa
yarpaqlarının elektroforetik spektrlərində uyğun
izoformaların intensivliyi artmışdır (Şəkil 5 və 6).
Şəkil 6-dan göründüyü kimi, arpa cücərtilərinin
elektroforetik spektrlərində APO-nun mütəhərrik-
liyinə görə fərqlənən iki (Rf 0,89 və Rf 0,96),
Hüseynova və b.
11
katalazanın isə bir izoforması müşahidə olunmuşdur.
Analoji nəticələr digər müəlliflər tərəfindən də
alınmışdır (Kim et al., 2005; Domanskaya et al.,
2009).
Şəkil 5. Torpaq quraqlığı zamanı arpa genotiplərinin
yarpaqlarında katalaza fermentinin izoenzim tərkibi: 1-
K-2778, 2- St. Pallidum 596; a – suvarılan, b – quraqlıq.
Şəkil 6. Torpaq quraqlığı zamanı arpa genotiplərinin
yarpaqlarında askorbatperoksidaza fermentinin izoenzim
tərkibi: 1 - K-2778, 2 – St.Pallidum 596 sortu; a –
normal suvarma, b – quraqlıq; APO1, APO2 – fermentin
uyğun izoformaları; R – rəngləyici.
Beləliklə, aparılan tədqiqatlar zamanı əldə olu-
nan məlumatlar əsasında belə nəticəyə gəlmək olar ki,
arpa genotiplərinin quraqlığa davamlılığı onların anti-
oksidant müdafiə sistemi ilə sıx bağlıdır. Bəzi
oksidləşmə stresi fermentlərinin fəallıqları ilə onların
çoxsaylı izoenzimlərinin müqayisəli analizinin öyrə-
nilməsi istiqamətində apardığımız biokimyəvi tədqi-
qatlar quraqlıq şəraitində arpa bitkisində bu fermen-
tlərin fermentativ fəallıqlarını qiymətləndirməyə və bu
göstəricini fizioloji və morfoloji proseslərlə əlaqələn-
dirməyə imkan verir. Quraqlıq zamanı antioksidant
fermentlərin fəallıqlarının və izoenzim tərkibinin kə-
miyyət və keyfiyyət dəyişmələri arpa bitkisinin eks-
tremal şəraitdə öz həyati funksiyalarını və homeostazı
qoruyub saxlamasını təmin edir. Aparılmış tədqiqat-
ların nəticələri bitkilərdə quraqlığa davamlılığın qiy-
mətləndirilməsi üçün yeni test sistemlərin yaradıl-
masında nəzəri əsas rolunu oynaya bilər.
ƏDƏBİYYAT
Ahmad P., Jaleel C.A., Salem M.A., Nabi G.,
Sharma S. (2010) Roles of enzymatic and
nonenzymatic antioxidants in plants during abiot-
ic stress. Crit. Rev. Biotechnol., 30(3): 161-175.
Alscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. (2002)
Reactive oxygen species and antioxidants: Relation-
ships in green cells. Physiol. Plant., 100: 224-233.
Amini R. (2013) Drought stress tolerance of barley
(Hordeum vulgare L.) affected by priming with
PEG. Intl. J. Farm. and Allied Sci., 2(20): 803-808.
Apel K., Hirt H. (2004) Reactive oxygen species:
Metabolism, oxidative stress, and signal transduc-
tion. Ann. Rev. Plant Biol., 55: 373-399.
Aranjuelo I., Molero G., Erice G., Avice J.C.,
Nogués S. (2011) Plant physiology and proteomics
reveals the leaf response to drought in alfalfa
(Medicago sativa L.). J. Exp. Bot., 62: 111-123.
Ashraf M. (2010) Inducing drought tolerance in
plants: Recent advances. Biotech. Adv., 28: 169.
Badiani M., De Biasi M.G., Colognola M.,
Artemi F. (1990) Catalase, peroxidase and super-
oxide dismutase activities in seedlings submitted
to increasing water deficit. Agrochimica, 34: 90-
102.
Brou Y.C., Zeze A., Diouf O., Eyletters M.
(2007) Water stress induces overexpression of su-
peroxide dismutases that contribute to the protec-
tion of cowpea plants against oxidative stress. Af-
rican J. Biotech., 6 (17): 1982-1986.
Domanskaya I.N., Budakova E.A., Samovich
T.V., Spivak E.A., Shaligo N.V. (2009) Activi-
ties of the antioxidant enzymes in green seedlings
of barley (Hordeum vulgare) under drought condi-
tions. Proceedings of the Academy of sciences of
Belarus (Series of Biological Sciences), 4: 45-49.
Faize M., Burgos L., Faize L., Piqueras A., Nico-
las E., Barba-Espin G., Clemente-Moreno
M.J., Alcobendas R., Artlip T., Hernandez J.A.
(2011) Involvement of cytosolic ascorbate perox-
idase and Cu/Zn-superoxide dismutase for im-
proved tolerance against drought stress. J. Exp.
Bot., 62(8): 2599-613
Fayez K.A., Bazaid S.A. (2014) Improving
drought and salinity tolerance in barley by appli-
cation of salicylic acid and potassium nitrate.
Journal of the Saudi Society of Agricultural Sci-
ences, 13: 45-55.
Fu J., Huang B. (2001) Involvement of antioxi-
dants and lipid peroxidation in the adaptation of
two cool-season grasses to localized drought
stress. Environ. Exp. Bot., 45: 105-114.
Joseph B., Jini D. (2011) Development of salt
stress-tolerant plants by gene manipulation of an-
tioxidant enzymes. Asian J. Agric., 5: 17-27.
Kim S. Y., Lim J.H., Park M.R., Kim Y.J., Park
1a 1b 2a 2b
KAT
APO1
APO2
1a 1b 2a 2b
R-rəngləyici
Rf 0,89
Rf 0,96
Quraqlığın Təsirinə Məruz Qalmış Arpa Genotiplərinin
12
T.I., Seo Y.W., Choi K.G., Yun S.J. (2005) En-
hanced antioxidant enzymes are associated with
reduced hydrogen peroxide in barley roots under
saline stress. Journal of Biochemistry and Molec-
ular Biology, 38 (2): 218-224.
Kumar C.N., Knowles N. (1993) Changes in lipid
peroxidation and lipolytic and free-radical scav-
enging enzyme during aging and sprouting of po-
tato (Solanum tuberosum L.) seed-tubers. Plant
Physiol., 102: 115-124.
Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural pro-
teins during the assembly of the head of Bacterio-
phage T4. Nature, 227: 680-685.
Li Z., Shi P., Peng Y. (2013) Improved drought
tolerance through drought preconditioning associ-
ated with changes in antioxidant enzyme activi-
ties, gene expression and osmoregulatory solutes
accumulation in White clover (Trifolium repens
L.). Plant Omics Journal, 6(6): 481-489 .
Mhamdi A., Queval G., Chaouch S.,
Vanderauwera S., Van Breusegem F., Noctor
G. (2010) Catalase function in plants: a focus on
Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J.
Exp. Bot., 61(15): 4197-220
Mittler R., Zilinskas B.A. (1993). Detection of
ascorbate peroxidase activity in native gels by in-
hibition of the ascorbate-dependent reduction of
nitroblue tetrazolium. Ana1. Biochem., 212: 540-
546.
Mittler R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and
stress tolerance. Trends Plant Sci., 7: 405-410.
Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van
Breusegem F. (2004) Reactive oxygen gene net-
work of plants. Trends Plant Sci, 9, 1360-1385.
Najami N., Janda T., Barriah W., Kayam G.,
Tal M., Guy M., Volokita M. (2008) Ascorbate
peroxidase gene family in tomato: its identifica-
tion and characterization. Mol. Genet. Genomics,
279: 171-182.
Nakano Y. and Asada K. (1981) Hydrogen perox-
ide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase
in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol., 22:
867-880.
Polesskaya O.G. (2007) Plant cell and reactive ox-
ygen species. Yermakov, I.P. Ed., Moscow, 140
Raychaudhuri S.S. (2000) The role of superoxide
dismutase in combating oxidative stress in higher
plants. Bot. Rev., 66: 89-98.
Romero-Puertas M.C., Corpas F.J., Sandalio
L.M., Leterrier M., Rodriguez-Serrano M., Del
Rio L.A. (2006) Glutathione reductase from pea
leaves: response to abiotic stress and characteriza-
tion of the peroxisomal isozyme. New Phytol.,
170: 43-52.
Sarowar S., Kim E.N., Kim Y.J., Ok S.H., Kim
K.D., Hwang B.K., Shin J.S. (2005) Overexpres-
sion of a pepper ascorbate peroxidase-like 1 gene
in tobacco plants enhances tolerance to oxidative
stress and pathogens. Plant Sci., 169: 55-63.
Saruhan N., Terzi N., Saglam A., Kadıoglu A.
(2009) The relationship between leaf rolling and
ascorbate-glutathione cycle enzymes in apoplastic
and symplastic areas of Ctenanthe Setosa subject-
ed to drought stress. Biol. Res., 42: 315-326.
Sarvajeet S.G., Narendra T. (2010) Reactive ox-
ygen species and antioxidant machinery in abiotic
stress tolerance in crop plants. Plant Physiology
and Biochemistry, 48 (12): 909-930.
Sedmak J.J., Grossberg S.E. (1977) A rapid, sen-
sitive, and versatile assay for protein using
Coomassie brilliant blue G 250. Anal. Biochem.,
79: 544-552.
Shaaltiel Y., Chua N.H., Gepstein S., Gressel J.
(1988) Dominant pleiotropy controls enzymes co-
segregating with paraquet resistance in Conyza
bonariensis. Theor. Appl. Genet., 75: 850-856.
Shao H.B., Liang Z.S., Shao M.A., Su Q. (2005)
Dynamic changes of antioxidative enzymes of 10
wheat genotypes at soil water deficits. Colloids
and Surfaces B: Biointerfaces, 42:187-195.
Solomon S., Qin D., Manning M., Alley R.B.,
Berntsen T., Bindoff N.L., Chen Z.,
Chidthaisong A., Gregory J.M., Hegerl G.C.,
Heimann M., Hewitson B., Hoskins B.J., Joos
F., Jouzel J., Kattsov V., Lohmann U.,
Matsuno T., Molina M., Nicholls N., Overpeck
J., Raga G., Ramaswamy V., Ren J., Rusticucci
M., Somerville R., Stocker T.F., Whetton P.,
Wood R.A., Wratt D. (2007) Technical Sum-
mary. In: Solomon S., Qin D., Manning M., Chen
Z., Marquis M., Averyt K.B., Tignor M. and Mil-
ler H.L. Ed., Climate Change 2007: The Physical
Science Basis. Contribution of Working Group I
to the Fourth Assessment Report of the Intergov-
ernmental Panel on Climate Change. Cambridge
University Press, Cambridge, United Kingdom
and New York, NY, USA.
Woodbury W., Spenser A. K., Stahmann M. A.
(1971) An improved procedure using ferricyanide
for detecting catalase isoenzymes. Anal.
Biochem., 41: 301-305.
Yannarelli G.G. (2007) Glutathione reductase ac-
tivity and isoforms in leaves and roots of wheat
plants subjected to cadmium stress. Phytochem.,
68: 505-512.
Yoshimura K., Yabuta Y., Ishikawa T., Shige-
oka S. (2000) Expression of spinach ascorbate pe-
roxidase isoenzymes in response to oxidative
stresses. Plant Physiol., 123(1): 223-234.
Zhang J., Kirkham M.B. (1994) Drought-stress-
induced changes in activities of superoxide dis-
mutase, catalase and peroxidase in wheat species.
Plant Cell Physiol., 35(5): 785-791.
Hüseynova və b.
13
Исследование Активности и Изоферментного Состава Антиоксидантных Ферментов в Листьях
Генотипов Ячменя (Hordeum vulgare L.), Подверженных Воздействию Засухи
И.М. Гусейнова
1
, М.Я. Насруллаева
2
, С.М. Рустамова
1
, Д.Р. Алиева
1
, Д.А. Алиев
1
1
Институт ботаники НАНА
2
Институт генетических ресурсов НАНА
Засуха является одним из основных стрессовых факторов, снижающих урожайность и качество зерна
растений во всем мире. Ячмень, обладая богатым генетическим разнообразием, является важным объек-
том для оценки ответных реакций контрастных генотипов на неблагоприятные факторы окружающей
среды. Антиоксидантный метаболизм может сыграть важную роль в ответных реакциях растений на за-
суху. Главной целью данной работы являлось определение вариаций засухоустойчивости генотипов яч-
меня на основе выявленных различий в уровне антиоксидантных ферментов во время засухи. Исследо-
ваны активность и изоферментный состав антиоксидантных ферментов каталазы (КАТ), аскорбатперок-
сидазы (АПО), глутатионредуктазы (ГР) и супероксиддисмутазы (СОД) у 4 генотипов ячменя, подвер-
женных почвенной засухе. При засухе у всех генотипов наблюдалось повышение активности КАТ и
СОД, и в то же время снижение активности АПО. В условиях сильной засухи общая активность ГР у ге-
нотипов К 2778 и St.Карабах 7 была повышена, тогда как у генотипов №77 Local и St.Pallidum 596, на-
оборот, понижена. По сравнению с образцами, выращенными при нормальных условиях, при стрессе
существенных различий в изоферментном составе (образование или исчезновение новых изоформ) не
наблюдалось, хотя в электрофоретических спектрах была повышена интенсивность полос соответст-
вующих изоформ.
Ключевые слова: Hordeum vulgare L., засуха, активные формы кислорода, антиоксидантные
ферменты, изоферментный состав
Study of the Activity and Isoenzyme Composition of Antioxidant Enzymes in the leaves of Barley
(Hordeum vulgare L.) Genotypes Subjected to Drought Stress
I.M.Huseynova
1
, M.Y.Nasrullayeva
2
, S.M.Rustamova
1
, D.R.Aliyeva
1
, J.A.Aliyev
1
1
Institute of Botany, ANAS
2
Institute of Genetic Resourses, ANAS
Drought is one of the major factors limiting the yield and quality of crops worldwide. Barley characterized
by high genetic diversity constitutes a valuable source for assessment of the responses of contrast genotypes
to environmental constraints. Antioxidative metabolism plays an important role in plant responses to
drought. The main aim of the study was to define variations in drought-tolerance of barley genotypes based
on the obtained differencies in the levels of antioxidant enzymes during the drought stress. The activities and
isoform profiles of catalase (CАТ), ascorbate peroxidase (APX), glutathione reductase (GR), and superox-
ide dismutase (SOD) were analyzed in four barley genotypes grown under soil drought. Drought stress
caused an increase in the activities of CАТ and SOD in all studied genotypes, while APX activity decreased.
The total GR activity increased substantially in genotypes K 2778 and St.Garabag 7 and decreased in №77
local and St.Pallidum 596 genotypes under severe water stress. No detectable differences were observed in
the isoenzyme composition (appearance or loss of new isoenzymes) of plants subjected to soil drought in
contrast to control ones. However, the bands of corresponding isoforms in electrophoretic spectra were in-
tensified in stressed barley leaves.
Key words: Hordeum vulgare L ., drought stress, reactive oxygen species, antioxidant enzymes, isoenzyme
composition
Dostları ilə paylaş: |