существенную роль в поддержании внутренних физиологических условий растительных
клеток, что придает особое значение исследованию свойств и механизмов.
Внутриклеточное распределение изоферментов малатдегидрогеназы
Проблема, связанная с идентификацией изоэнзимов МДГ, касается, прежде всего,
растительных организмов, так как в клетках других живых существ содержится лищь две
фракции, обладающие МДГ активностью: митохондриальная и цитоплазматическая.
Данная субклеточная локализация МДГ касается не только клеток животных [23], но и
таких организмов как грибы [35] и эвглены [30]. В клетках бактерий обнаруживается
лишь цитоплазматическая МДГ (цМДГ) [38]. Однако в клетках животных (цМДГ) и
митохондриальный (мМДГ) изоэнзимы МДГ могут быть представлены несколькими
молекулярными изоформами. Например, изоэнзимный спектр МДГ из печени курицы
состоит из 3 фракций, обладающих МДГ активностью. Одна из них соответствует
мМДГ, тогда как две остальные относятся к цитоплазме. Последние содержат по 4
субформы, которые по всей вероятности являются различными конформерами нативных
изоэнзимов.
Присутствие в клетках растений до щести изоэнзимов МДГ, обладающих
различной субклеточной локализацией, значительно осложняет исследование
ферментной системы из данных объектов. Большинство сведений о МДГ растительного
происхождения имеет неполный и противоречивый характер, прежде всего потому, что
во многих случаях изучались суммарные, частично очищенные и неидентифицированные
препараты данного белка [11].
Мало внимания уделялось вопросу о внутриклеточной локализации МДГ из
растительных организмов. Открытие изоэнзимов МДГ в разных компартментах
растительной клетки является событием сравнительно небольшой давности. О
существовании мМДГ и цМДГ было известно уже с начала 60-х годов, когда
осуществлялись первые попытки частично очищать и изучать этот энзим из
растительных объектов.
Другие изоэнзимы МДГ растительной клетки были открыты позже, по мере
изучения ее альтернативных метаболических путей. Пластидная МДГ была впервые
выявлена в листьях шпината. Основной энзим, обладающий МДГ активностью,
хлоропластов представляет собой НАД [31].
Одна из первых работ по изучению глиоксисомальной МДГ (гМДГ) была
выполнена Рочой и Тингом [50]. гМДГ особенно активна в молодых прорастающих или
запасаюищх органах масличных растений, как например, в эндосперме клещевины
(Ricinus communis). Где этот изоэнзим выполняет функции, связанные с мобилизацией и
утилизацией запасных жирных кислот при прорастании.
Особый интерес, с нашей точки зрения, представляют вопросы о свойствах и
происхождении гМДГ, которые должны быть рассмотрены наряду с исследованием
изоэнзимов, локализованных в других компартментах клетки и, прежде всего, в
пероксисомах. Пероксисомы представляют собой специализированные органеллы
зеленых листьев растений, связанные с протеканием фотодыхания и гликолатного цикла
[4].
Пероксисомальная МДГ (пМДГ) впервые была обнаружена при изучении
субклеточной локализации энзима в клетках листьев шпината [63]. Наибольшая доля
активности МДГ в этих органах приходится на фракцию пероксисом и митохондрий.
Соотношение между изоэнзимами МДГ в клетке зависит от исследуемого органа
растений, и от преобладающих в нем метаболических функций. В молодых и запасающих
тканях растений преобладает активность мМДГ и гМДГ (в эндосперме клещевины и
щитке кукурузы), тогда как в корнях наиболее активной является цМДГ, а в зеленых
листьях мМДГ и пероксимальная формы энзима [63]. Поэтому, изучение субклеточной
локализации и соотношения между изоэнзимами МДГ в органах растений может дать
ценные сведения о тех метаболических процессах, которые преобладают в них при
определенных физиологических условиях.
По нашим данным 70%-ов общей активности НАДФ-МДГ локализована в
хлоропластах, 20-25%-ов в цитозоле, а 5-10%-ов в митохондриях клеток мезофилла
флаговых листьев пшеницы сортов азербайджанской селекции.
Но распределение активности НАД-малик энзима в листьях С
4
-растения амаранта
отличается друг от друга в зависимости от их тканевой принадлежности. Было
обнаружено, что в хлоропластах обоих ассимиляционных тканей листьев не было
обнаружено активность НАД-МЭ. 90,6%-ов от общей активности НАД-МЭ связана с
митохондриями обкладки, в то время всего 9,4%-а активности фермента обнаружена в
цитозоле обкладки. Эти показатели в мезофильных клетках листьев амаранта
оценивается так, что 60,2% от общей активности фермента локализована в строме
митохондрии, а 39,8% активность НАД-МЭ локализована в цитозоле того же ткани [16;
47].
Физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы
МДГ была очищена до гомогенного состояния и получена в кристаллическом виде
из животных, микроорганизмов и растений [64]. Применяемые методики выделения и
очистки фермента отличаются большим разнообразием и длительностью. Наиболее
эффективными являются аффинные методы очистки, позволяющие получить гомогенный
белок быстро и с большим выходом [51]. Величина удельной активности гомогенных
препаратов колеблется в пределах 1000-1700 ФЕ/мг белка [16]. Фермент обладает
высокой стабильностью и может сохранять активность в течение нескольких месяцев,
что позволяет использовать его в качестве биохимического реагента в научных
исследованиях [3; 2]. Величина молекулярной массы фермента зависит от источника его
выделения. Для ряда бактерий, микроводорослей характерна величина молекулярной
массы МДГ 100-500 кДа. Высокая молекулярная масса МДГ из некоторых растительных
объектов объясняется образованием комплекса фермента с другими белками или
ферментами, поскольку эти величины получены на основании данных электрофореза
гомогенатов тканей [2]. Очищенный фермент обычно имеет молекулярную массу 60-70
кДа и представляет собой изологические димеры [32]. При этом молекулярная масса их
идентичных субъединиц колеблется от 30 до 45 кДа.
Oписывающие функциональные единицы МДГ гетерологические, т.е. состоящие из
двух неидентичных субъединиц [60]. Показано, что мономерная форма фермента обычно
неактивна. По всей видимости, кроме димеров, в природе встречаются тетрамеры [22],
которые имеют в основном бактериальное происхождение или локализуются в
хлоропластах и митохондриях высших организмов. Некоторые авторы описывают
существование in vivo олигомеров МДГ более высокого порядка, т.е. гексамеров и
октамеров [28]. Такие формы, возможно, возникают в результате олигомеризации
функциональных единиц МДГ и возникающее при этом динамическое равновесие между
ними играет важную роль в регуляции функционального состояния и активности МДГ.
МДГ различного происхождения характеризуется высоким сродством к ОА-у (K
m
=
5,7-180 мкМ), НАДН (К
т
=4-324 мкМ) и НАД (К
т
=0,1-1 мМ). Сродство к малату варьирует
наиболее сильно (0,05-25 мМ) [2;15]. При этом обнаружено, что растительная МДГ
характеризуется более низким сродством к малате, что обусловлено особенностями их
метаболизма. Величины оптимума рН для реакций окисления малата и восстановления
ОА также различаются довольно значительно. Так, если рН оптимум для реакции
восстановления ОА находится в пределах 6,4-8,4, то для реакции окисления малата он
равен 9-10.
НАДФ - МДГ выделена и очищена из хлоропластов гороха и кукурузы.
Установлено, что фермент состоит из четырех субъединиц и обладает молекулярной
массой 150 кДа [14; 55]. НАДФ - МДГ обладает чрезвычайно высоким сродством к ОА-у
(К
т
=18-56 мкМ), НАДФН (24-70 мкМ), НАДФ (40-250 мкМ) и низким сродством к малату
Dostları ilə paylaş: |