Essential 6 Medium



Yüklə 56,44 Kb.
Pdf görüntüsü
tarix13.11.2017
ölçüsü56,44 Kb.
#10197


 

 

Publication Number MAN0007568 



Document Part Number A15166 

Revision 2.0 

Essential 6

 Medium 



Description 

Essential 6

 Medium is a fully-defined, xeno-free medium, which supports reprogramming of somatic cells and the differentiation of 



human pluripotent stem cells. Essential 6

 Medium requires the addition of basic fibroblast growth factor (bFGF) when reprogramming 



human cells. 

Product 


Catalog No. 

Amount 


Storage 

Shelf Life* 

Essential 6

 Medium 



A1516501 

500 mL 


Store at 2–8°C. Protect from light 

12 months 

* Shelf Life duration is determined from Date of Manufacture. 

Product Use 

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 



Safety Information 

Read the Safety Data Sheets (SDSs) and follow the handling 

instructions. Wear appropriate protective eyewear, clothing, and 

gloves. 


Culture Conditions 

Media

: Essential 6

 Medium 


Cell Line

: Human pluripotent stem cells (PSCs) 



Temperature Range: 

37°C 


Incubator Atmosphere Range:

 Humidified atmosphere of 5% CO

2

 

Culture Type:



 Adherent 

Recommended Culture Vessels:

 Induced pluripotent stem cells 

(iPSCs) can be derived and/or differentiated in complete 

Essential 6

 Medium on vitronectin (VTN-N)-coated, tissue 



culture-treated vessels.  

Ensure proper gas exchange and minimize exposure of cultures to 

light. 

Derivation of Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) in 

Essential 6



 Medium 

Reprogramming Fibroblasts using Episomal iPSC 

Reprogramming Vectors 

Day –4 to –2: 

Plate human fibroblasts into a T75 flask in 

fibroblast medium so that they are 75–90% confluent on the day 

of transfection (Day 0). 



Day 0: 

Transfect the cells using the Neon

®

 Transfection System. 



Plate transfected cells onto vitronectin-coated culture dishes and 

incubate overnight in Essential 8

 Medium supplemented with 



hydrocortisone (1 µM). 

Day 1 to Day 5–10: 

Replace the spent medium with fresh 

Essential 8

 Medium with hydrocortisone (1 µM); change the 



spent medium every other day.  

Day 5–10 to Day 25–30:

 Replace the medium with Essential 6

 

Medium supplemented with bFGF (100 ng/mL). Continue 



culturing the cells, changing the spent medium every other day.  

Day 25–30: 

Pick, transfer, and change the medium to Essential 8

 

Medium. 



Reprogramming Fibroblasts using CytoTune



-iPS Sendai 

Reprogramming Kit 

Day –2:

 Two days before transduction, plate human neonatal 

foreskin fibroblast cells into two wells of a 6-well plate at the 

appropriate density to achieve 80–90% confluency per well on 

the day of transduction (Day 0). 

Day 0:

 Perform transduction.  



Day 1:

 24 hours after transduction, replace the medium with fresh 

fibroblast medium. Culture the cells for 5 more days, changing the 

spent medium with fresh fibroblast medium every other day. 



Day 6:

 Replace the medium with Essential 6

 Medium 


supplemented with bFGF (100 ng/mL). 

Day 7:

 Harvest cells and seed on vitronectin-coated (1 µg/cm

2



plates using Essential 6



 Medium supplemented with bFGF 

(100 ng/mL); replace the spent medium every day thereafter. 

Day 8 to 28: 

Feed and monitor the cells. When colonies are ready 

for transfer, perform live staining using Tra1-60 or Tra1-81 to 

select reprogrammed colonies. Manually pick colonies and 

transfer them onto prepared vitronectin-coated plates and 

culture them in Essential 8

 Medium.  



Note: 

Colonies are typically ready to be picked at Day 21, but 

they may require a few additional days depending on the 

somatic cell line. 



Identifying iPSC colonies 

By Day 21 post-transduction, the cell colonies on the vitronectin-

coated plates are large and compact, covering the majority of the 

surface area of the culture vessel. However, only a fraction of 

these colonies will consist of iPSCs, which exhibit a hESC-like 

morphology characterized by a flatter cobblestone-like 

appearance with individual cells clearly demarcated from each 

other in the colonies. Therefore, we recommend that you perform 

live staining with Tra1-60 or Tra1-81 antibodies that recognize 

undifferentiated iPSCs.  



Picking iPSC colonies  

1.

 



Place the culture dish containing the reprogrammed cells 

under an inverted microscope and examine the colonies 

under 10X magnification. 

2.

 



Mark the colony to be picked on the bottom of the culture 

dish. 


Note:

 We recommend picking at least 10 distinct colonies by 

the end of each reprogramming experiment and expanding 

them in separate 24-well culture plates. 

3.

 

Transfer the culture dish to a sterile cell culture hood (i.e., 



biosafety cabinet) equipped with a stereomicroscope. 

4.

 



Using a 25-gauge 1½-inch needle, cut the colony to be picked 

into 5–6 pieces in a grid-like pattern. 

5.

 

Using a 200 μL pipette, transfer the cut pieces to one well of 



a freshly prepared 24-well vitronectin coated culture plate 

containing human Essential 8

 Medium. 



6.

 

Incubate the culture plate containing the picked colonies in a 



37°C incubator with a humidified atmosphere of 5% CO

2



7.

 

Allow the colonies to attach to the culture plate for 48 hours 



before replacing the spent medium. After that, change the 

medium every day. 

8.

 

Treat the reprogrammed colonies like normal human ESC 



colonies and passage, expand, and maintain them using 

standard culture procedures until you have frozen cells from 

two 60-mm plates.  

 



 

For additional technical information such as Safety Data Sheets (SDS), Certificates of Analysis, visit 

www.lifetechnologies.com/support

.  


For further assistance, email 

techsupport@lifetech.com

  

© 2013 Life Technologies Corporation. All rights reserved. The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation and/or their affiliate(s) or their 



respective owners. Dispase

®

 is a registered trademark of Godo Shusei Co., Ltd., Tokyo, Japan. CytoTune is a registered trademark of DNAVEC Corporation. 



DISCLAIMER: LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION AND/OR ITS AFFILIATE(S) DISCLAIM ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED,  

INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY, FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE, OR NON-INFRINGEMENT.  TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW,  

IN NO EVENT SHALL LIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER  

BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING  

BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF. 

www.lifetechnologies.com

 

Embryoid Body (EB) formation using Essential 6



 Medium 

Note:

 We recommend picking at least 10 distinct colonies by the 

end of each reprogramming experiment and expanding them in 

separate 24-well culture plates. 

1.

 

Observe the human iPSCs growing in Essential 8



 Medium 


under the microscope to confirm that the cells are 70–80% 

confluent and ready to be subcultured. 

2.

 

Cut out and remove any differentiated colonies prior to 



passaging the culture. 

3.

 



Pre-warm the required volume of Dispase

®

 solution 



(2 mg/mL) and Essential 6

 Medium in a 37°C water bath for 



15 minutes.  

4.

 



Aspirate the spent medium from the culture dish using a 

pipette, and rinse the cells twice with DPBS, no calcium, no 

magnesium. 

5.

 



Gently add pre-warmed Dispase

®

 solution to the culture 



dish (e.g., 1 mL of Dispase

®

 solution per 60-mm culture 



dish). Swirl the culture dish to coat the entire cell surface. 

6.

 



Incubate the culture dish at 37°C for 3 minutes. 

7.

 



Remove the dish from the incubator, aspirate the Dispase

®

 



solution, and gently wash the cells with DPBS, no calcium, 

no magnesium. 

8.

 

Gently scrape the cells off the surface of the culture dish 



using a cell scraper, and transfer the cells to a sterile 15-mL 

centrifuge tube. 

9.

 

Rinse the culture dish twice with DPBS, no calcium, no 



magnesium, gently “spraying off” any cells that have not 

detached. Pool the rinse with the cells in the 15-mL tube. 

10.

 

Centrifuge the tube at 200 × g for 5 minutes at room 



temperature to pellet the cells. 

11.


 

Carefully aspirate the supernatant without disturbing the 

cell pellet and discard it. 

12.


 

Gently flick the tube to fully dislodge the cell pellet from the 

tube bottom, and gently resuspend the cells in pre-warmed 

Essential 6

 Medium using a 5-mL serological pipette. Do 



not triturate.  

Note:

 It is critical to gently resuspend the cells without using 

force to avoid damage. 

13.


 

Transfer the cells onto a 60-mm or a 100-mm non-tissue 

culture-treated dish (i.e., the EB dish).  

14.


 

Place the EB dish in a 37°C incubator with a humidified 

atmosphere of 5% CO

2

 in air. 



15.

 

Change the medium on the EBs every other day by 



transferring the entire volume of the dish into a centrifuge 

tube. Keep the tube in the hood and allow the cells to settle 

to the bottom of the tube (about 5 minutes). Then, using a 

pipette, remove the supernatant from the tube and replace it 

with fresh Essential 6

 Medium. Place the cells back onto the 



same dish. 

 

16.



 

Continue to change the medium every other day.  

The EBs will grow in size over time. 

17.


 

After 7 days, transfer the cells into a 100-mm Geltrex

®

-coated 


tissue culture-treated dish to allow for attachment. Incubate 

the EBs in a 37°C, 5% CO

2

 incubator.  



18.

 

Replace spent medium every other day. 



19.

 

Allow the cells to expand for 14–21 days, or even longer. The 



entire EB dish can be immunostained or harvested for 

analysis by PCR at 14 days, 21 days, or later. 

For detailed protocols, visit 

www.lifetechnologies.com/protocols

.

 

Related Products



 

Product 


Cat. No. 

Essential 8

 Medium 


See below* 

Vitronectin, truncated human recombinant (VTN-N) 

A14701 

Episomal Reprogramming Vectors 



A14703 

CytoTune


-iPS Sendai Reprogramming Kit 

A13780 

Geltrex


 LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth 

Factor Basement Membrane Matrix 

A14133 


DPBS, no calcium, no magnesium 

14190 


Dispase

®

, powder 



17105 

FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein  

PHG0261 

* Refer to 



www.lifetechnologies.com/Essential8

.   


Explanation of Symbols and Warnings 

The symbols present on the product label are explained below: 

 

 

 



 

 

Caution, consult 



accompanying 

documents 

Temperature 

Limitation 

Protect from light 

Use By: 


Consult 

instructions 

for use 

 

 



 

 

 



Batch Code 

Catalog 


number 

Manufacturer 

Sterilized using 

aseptic 


processing 

techniques 

 

Limited Product Warranty 

Life Technologies Corporation and/or its affiliate(s) warrant 

their products as set forth in the Life Technologies’ General 

Terms and Conditions of Sale found on Life Technologies’ 

website at 

www.lifetechnologies.com/termsandconditions

. If 


you have any questions, please contact Life Technologies at 

www.lifetechnologies.com/support



Document Outline

  • Essential 6™ Medium
  • Description
  • Shelf Life*
  • Storage
  • Amount
  • Catalog No.
  • Product
  • 12 months
  • 500 mL
  • A1516501
  • Product Use
  • Safety Information
  • Culture Conditions
  • Derivation of Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) in Essential 6™ Medium
  • Identifying iPSC colonies
  • Picking iPSC colonies
  • Embryoid Body (EB) formation using Essential 6™ Medium
  • FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein 
  • * Refer to www.lifetechnologies.com/Essential8.
  • Explanation of Symbols and Warnings
  • Limited Product Warranty


Yüklə 56,44 Kb.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2023
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə