+ - hüceyrə periferiyasında zəif sarımtıl-yaşıl və ya bozum
tul işıq saçma.
İm m unoferm ent analizi. /İFA /. İFA- modifikasiya qru
pundan ibarət olub buna ELİSA üsulu /enzimə-Linked immuno
sorbent assay/ aiddir. Bu üsulun mahiyyəti antigen və antitellə-
rin nişalanması üçün fermentlərdən istifadə olunmasıdır. Bu
üsuldan quşların infeksion, şiş və digər xəstəliklərinin ilk dövr
lərinin diaqnosikasında, quşçuluq təsərüfatlarda epizootik və
ziyyətin müəyyən edilməsində, postvaksinal antitellərini sə
viyyəsinin təyinində, bioloji və mikrobioloji sənayenin məhsul
larının keyfiyyətinə nəzarət edilməsində və s. istifadə edilir.
Hal-hazırda daha çox İFA-nın bərkfazalı variantı və o
cümlədən ELİSA tətbiq edilir.
ELİSA-nın aşağıdakı şəkildəyişmələri mövcuddur: rəqib
ELİSA, «sendviç»-ELİSA /ikiqat antitel üsulu/ modofıkasiyası
«sendviç»-ELİSA, vasitəsiz ELİSA və s.
Vasitəsiz ELİSA o vaxt tətbiq olunur ki, tədqiqatçı az miq
darda antitellə üzləşir. Bu variantda növəleyhinə nişanlanmış
antitel götürülür. «Sendviç » ELİSA metodunun əvvəlki metod
dan bir çox üstünlüyü mövcuddur. Birinci müxtəlif antigenlərin
aşkar edilməsi üçün yalnız bir nişanlanmış növəleyhinə serum-
dan istifadə edilir. İkinci, təmizləmə və markirovka təcrübəsin
də çoxlu miqdarda nadir spesifik serum sərf olunmur, halbuki
antiqlobulinlər həmişə kifayət miqdarda olur. Üçüncü, ikiqat
«sendviç» yüksək dərəcədə həssaslığa malikdir, çünki spesifik
antitelin bir malekulası bir neçə malckula nişanlanmış antiqlobu-
Iinlə reaksiya verir, bu da siqnalın güclənməsinə səbəb olur.
Nişanlanmış antitelləri istifadə etməklə kəmiyyət immunoa-
nalizlərinin bütün variantları aşağıda göstərilən üsütnlüklərə
malikdir. 1) Antigen nişanlanmır, ona görə də onun zədələnmə-
si və ya fiziki kimyəvi xüsusiyyətlərinin dəyişməsi qeyd olun
mur. 2) Antitel molekulları daha çox stabildir, nişanlama zama
70
nı o qədər də zədələnm ir və radiozitoplarla nişanlanan zamanı
radiolizə daha çox davamlılıq göstərir. 3) Çətin nişanlanan və ya
təm iz halda alınması çətin olan antigenləri təyin etmək
mümkündür. 4) nişanlanmış antitellərin çox istifadə edilməsi
nəicəsində daha çox həssaslıq və spesifiklik müşahidə edilir.
Antitellər. Serumların qiymətləndirilməsi göstəriciləri bun
lardır: avidlik, spesifiklik və əlverişlilik KBR-da istifadə edilən
aşağı titrli serumlar çox vaxt İFA üçün kifayət qədər spesifik ol
mur.
Bərk fazalı kəmiyyət immunitestlərində həm bərk fazanın
hazırlanması və həm də nişanlanma üçün ya - qlobulin fraksiya
sını və ya L q G.yaxud da immunosorbsiya nəticəsində alınmış
təmiz antitellər istifadə edilir.
Bərk cisimlər. Nişanlanmış reagentlər istifadə edilən kə
miyyət immunoloji metodlarla azad və əlaqəli nişanlanmanın
ayrılması mərhələsi çox vacibdir ki, bura da ən sadə üsul bərk-
fazalı üsul hesab edilir. Bərk fazalı daşıyıcılar kimi sintetik poli-
merlər - polistirol, polipropilen, plivinil, dakreil və s. istifadə
edilir.
Yuvulma mərhələləri. ELİSA tip heterogen ferment immu-
noanalizləri müxtəlif reagentlərin bir sıra seriyasından ibarətdir
və burada ardıcıl şəkildə yuylma elə aparılmalıdır ki, reagentin
bir mərhələdən digərinə keçilməsi tam təmin edilmiş olsun.
Müxtəlif borucuqlar, planşetlər və s. məhluldan azad edilir və
tərkibində tvin-20 olan fosfat-bufer məhlulunun içərisində
müəyyən qədər saxlanır. Üç dəfə belə ardıcıl yuyulmadan sonra
planşet və digər polimer daşıyıcılarını qurudur və digər reagen-
ti əlavə edirlər.
Nəzarət nümunələri. Yüksək pozitiv nümunənin göstəricisi
nin JFA vasitəsiz variantında neqativ göstəriciyə olan nisbəti
5:1-ə olmalıdır. Serum nümunəsinin vasitəsiz nəzarətində digər
serum komponentləri ilə reaksiya verən sustansiyalar ola bilər
71
ki, bu zaman xromotoqrafıya, sentifıquraladınna və ya hər bir
immunoqlobulinə spesifik olan adsorbentlərdən istifadə etm ək
lə 1 q M və ya 1 q G-nin ayrılması meydana çıxır.
Fennentlər və substar sistemləri. Marker kimi götürülən fer-
mentlər stabil, yüksək reaktiv, təmiz, ucuz və tətbiqi zamanı
ucuz olmalıdır.
Belə təlabatlara peroksidaza, qələvi fosfataza, asetilxolines-
teraza, ribonukleaza və s. cavab verir. Permentin seçilməsi təb-
qiq olunan materialın xüsusiyyətlərindən və onun tədqiqi
müddətindən asılıdır. Eyni vaxtda çoxlu miqdarda nümunənin
analizi zamanı hansı ki, birinci və sont nümunənin tədqiq olun
ma müddəti tamamilə fərqlidir ELİSA metodun xətası arta bilər.
Belə hallarda daha çox stabil hidrolitik fermentləri, yəni qələvi
fosfatazanı və - qalaktozidazanı götürmək lazımdır. Nümunədə
olan aktivator və ingibitorlardan asılı olan ferm entlərin
göstürülməsi məsləhət bilinmir.
Substraf kimi qələvi, fosfataza üçün daha çox nitrofenolfos-
fat uyğun gəlir. Bu həb şəklində buraxılır və bundan asanlıqla
və həmiz halda işçi məhlul hazırlamaq mümkündür. Peroksida-
zanı aşkar etmək üçün ən yaxşı substar ortofenilendiamin hesab
edilir.
Ümumiyyətlə qələvi fosfataza və - qalaktozidaza ilə nişanlan
mış antitellərlə birlikdə ELİSA sistemi daha dəqiq nəticələr verir.
Fermentin zülalla konvuqasiva metodu. Fermentin antigen
və ya antitellə birləşməsi elə həyata keçirilməlidir ki, bunların
hər biri maksimal miqdarda öz aktivliyini saxlaya bilsin. Bu
məqsədlə ən azı iki olaraq aktiv qrupla birləşə bilən agent tətbiq
olunur. Belə agntlərə misal qluitaraldehidi, natrium-peryodenti
göstərmək olar.
Nəticələrin vizual şəklində təyini o vaxt tətbiq olunur ki, bu
rada «hə» və «yox» cavabı verilsin. Nəticələrin fotometrik
üsulla təyini daha dəqiqdir. Burada optiki sıxlıq / M + ) göstə
72
riciləri styudet kriterisinə müvafiq olaraq müəyyənləşdirilir.
ELİSA-nın avtomatlaşdırılması məşədilə «Dinatec» tipli
aparatlardan istifadə edilməsi məqsədə müvafiqdir.
Diaqnostik dəst preparatları bir neçə tipə bölünür:
1. Virus antigenləri / orqan və ya kulturalar )
2.
Peroksidaza ilə konyuqasiya edilmiş növ əleyhinə toyuq
immunoqlobulini
3.
Təyin olunan virusa görə təzə və ya liofilizasiya olunmuş
nəzarət hiperimmun serum.
4.
Toyuqların təzə və ya liofilizasiya olunmuş nəzarət mənfi
serumu.
5. Nəzarət mənfi antigen.
Tədqiqat işində PH 7,4 olan 0,01 M fosfat-bufer məhlulun
dan istifadə edilir. Bundan yuma məqsədilə və indikator sistemi
üçün 2 bufer hazırlanır.
Yuyucu bufer - tərkibində 0,5 % tvin-80 olan fsfat-bufer
məhluludur.
İndikator sistemi üçün bufer tətbiq olunmazdan əvvəl tünd
şüşə daxilində hazırlanır.hər 40 ml fosfat-bufer məhluluna 40
mq 5-aminazalisil turşusu 100 mq əküz serumu albimini əlavə
edilir.
Reaksiyanın gedişi aşağıdakı kimi həyata keçirilir.
1. Peroksidaza ilə nişanlanmış növ əleyhinə tovuq embrionu-
nun titrləsdirilməsi. l:10-də ilk durultma hazırlanır və bundan
isə planşetin gözcükləində 1:1000 və daha çox durultma dərəcə
ləri fosfat bufer məhlulu və normal serumu istifadə etməklə ha
zırlanır. 37° S temperaturda 2 saat müddətində inkubasiya etdiri
lir. Sonra planşetin gözcükləri yuyucu buferlə 3 dəfə yuyulur.
Sonra hər durultmaya bərabər həcmdə indikator sistemi buferi
tökülür. 37u S temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya edildikdən
sonra nəticəsi yoxlanır.
İntensiv palıdı rəng və bunun qara rəngə çevrilməsi baş ve
73
Dostları ilə paylaş: |