Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

UmuC test

UmuC test (Oda et al. 1985) je velmi citlivý screeningový test, pomocí kterého se detekují genotoxické účinky různých chemických látek. Tento test je součástí mezinárodních norem ISO 13829 (ISO 1997). Jako detekční systém se zde používá (stejně jako v Amesově testu) kmen Salmonella typhimurium TA 1535 s inkorporovaným plazmidem pSK1002, který nese umuC operon. Při poškození genetické informace dochází k okamžité aktivaci SOSreparačního systému (ten je spojen s umuCgenem a tvoří společně umuC operon. Tento operon je propojen s lacZgenem (umuC'::'LacZ), který nese informaci pro aktivaci βgalaktosidázy. Na základě aktivity βgalaktosidázy pak můžeme detekovat aktivaci umuC operonu a ta je tedy úměrná poškození DNA v buňce. Aktivitu βgalaktosidázy při tom sledujeme pomocí kolorimetrické přeměny substrátu (ONPG, CPRG).

Test je prováděna na 96jamkových mikrodestičkách (což výrazně minimalizuje materiálové náklady) a vyhodnocován pomocí spektrofotometru.

Obr. 7: Schéma principu UmuC testu. Převzato a upraveno z (Škarek 2001).

1. Příprava zamražené kultury

Lyofilizovanou bakterii získanou z kitu (UMUChromotest, EBPI, Kanada) otevřeme a rozpustíme ji ve 20 ml TGAmédia, převedeme do erlenmayerovy baňky a inkubujeme ji při 37 °C, 120 r.p.m. 14 – 16 hodin. Následující den změříme optickou hustotu při 600 nm a do inokula přidáme 50% glycerin (rozpuštěn ve sterilní destilované vodě) v poměru 3:1 (inokulum:glycerin). Do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek o objemu 0,75 ml pipetujeme 0,5 ml připraveného inokula v glycerinu. Kulturu ihned zamrazíme ve svislé poloze při 80 °C.

2. Provedení testu

Jako detekční systém je v našem provedení UmuC testu využíván kmen Salmonella typhimurium TA 1535/pSK1002 (komerční kit UMUChromotest, EBPI, Kanada). Zásobní bakteriální kultura je uchovávána v glycerinovém médiu.

1. Příprava médií

Tato část obsahuje návod na přípravu médií a roztoků. Sterilizace probíhá po 20 minut při 121 °C a pH je upravováno pomocí koncentrovaných roztoků HCl (37 g.l¹) a NaOH (40 g.l¹). Při přípravě je nutné dodržovat základní pravidla sterilní práce.

TGA médium

TGA médium představuje plnohodnotné růstové médium obohacené o ampicilin zajišťující selektivní přítomnost buněk s plazmidem pSK1002. TGA médium (100 ml) se připravuje smícháním vysterilizovaných 93 ml roztoku R1 a 2 ml roztoku R2. Po zchlazení se přidá 5 mg ampicilinu rozpuštěném v 5 ml sterilní vody.

R1 se připravuje rozpuštěním 1,0 g tryptonu, 0,5 g NaCl, 1,19 g HEPES v 93 ml destilované vody a upravením pH na 7,0 ± 0,2.

R2 se připravuje rozpuštěním 0,4 g D(+)glukózy v 4 ml destilované vody.

Uchováváme při 4 °C.

10x TGA médium

Koncentrované TGA médium je v samotném testu naředěno sterilní vodou a vzorkem tak, že konečná koncentrace živin i ampicilinu je srovnatelná s kultivačním plnohodnotným TGA médiem. 10x TGA médium (25 ml) se připravuje smícháním 18 ml roztoku R1 a 5 ml roztoku R2. Po zchlazení se přidá 12,5 mg ampicilinu rozpuštěného ve 2 ml sterilní vody.

R1 se připravuje rozpuštěním 2,5 g tryptonu, 1,25 g NaCl, 2,975 g HEPES v 18 ml destilované vody. PH se upraví na hodnotu 7,0 ± 0,2.

R2 se připravuje rozpuštěním 1,0 g D(+)glukózy v 10 ml destilované vody.

Uchováváme při 4 °C.

Bpufr

Bpufr obsahuje detergent, který narušuje buněčné stěny buněk a umožňuje uvolnění enzymu βgalaktosidázy z cytosolu, navíc svým pH a iontovou silou umožňuje optimální průběh enzymatické reakce s chromogenním substrátem.

Bpufr pro ONPG (250 ml) se připravuje rozpuštěním 10,15 g Na₂HPO₄ . 12 H₂O, 1,55 g NaH₂PO₄ . 2 H₂O, 0,188 g KCl a 0,063 g MgSO₄ . 7 H₂O v 230 ml sterilní vody. Po úpravě pH na 7,0 ± 0,2, doplníme roztok sterilní vodou do 250 ml a přidáme 0,25 g SDS. Těsně před použitím přidáme do 10 ml Bpufru 27 l βmerkaptoethanolu. Uchováváme při 4 °C.

Bpufr pro CPRG (250 ml) se připravuje rozpuštěním 5,67 g Na₂HPO₄ . 12 H₂O, 0,114 g KH₂PO₄, 0,188 g KCl a 0,024 g MgCl₂ . 6 H₂O v 230 ml sterilní vody. Po úpravě pH na 8,0 ± 0,2, doplníme roztok sterilní vodou do 250 ml a přidáme 0,25 g SDS. Těsně před použitím přidáme do 10 ml Bpufru 27 l βmerkaptoethanolu. Uchováváme při 4 °C.

Fosfátový pufr pro ONPG

Fosfátový pufr slouží jako vhodné rozpouštědlo pro chromogenní substrát ONPG, který nám umožňuje stanovit aktivitu βgalaktosidázy v roztoku. 100 ml se připraví rozpuštěním 2,18 g Na₂HPO₄ . 12 H₂O, 0,608 g NaH₂PO₄ . 2 H₂O ve 100 ml vody. Po úpravě pH na 7,0 ± 0,2 vysterilizujeme a uchováváme při 4 °C.

Fosfátový pufr pro CPRG

Fosfátový pufr slouží jako vhodné rozpouštědlo pro chromogenní substrát CPRG, který nám umožňuje stanovit aktivitu βgalaktosidázy v roztoku. 250 ml se připraví rozpuštěním 5,372 g Na₂HPO₄ . 12 H₂O, 0,05 g MgCl₂ . 6 H₂O a 0,186 g KCl ve 250 ml vody. Po úpravě pH na 8,0 ± 0,2 vysterilizujeme a uchováváme při 4 °C.

Roztok ONPG

2 hodiny před použitím se připraví roztok chromogenního substrátu rozpuštěním 13,5 mg ONPG ve 3 ml fosfátového pufru ve sterilní ampicilince. Uchováváme při teplotě místnosti za nepřístupu světla.

Roztok CPRG

2 hodiny před použitím se připraví roztok chromogenního substrátu rozpuštěním 3,4 mg CPRG ve 3 ml fosfátového pufru ve sterilní ampicilince. Uchováváme při teplotě místnosti za nepřístupu světla.

2. Pracovní postup

Předkultivace

Den před samotným provedením testu rozpustíme zamraženou kulturu S. typhimurium a z ampulky převedeme 300 μl do 20 ml čerstvého TGA média. Inkubujeme 14 – 16 hodin při 37 °C, 120 r.p.m. Následující den změříme optickou hustotu při 600 nm a naředíme kulturu čerstvým TGA médiem tak, aby hustota bakterie byla s absorbancí A₆₀₀ = 0,08. Výpočet je uveden níže:

 

Kde OD je optická densita naměřená při vlnové délce 600 nm, V je objem inokula, který potřebný pro všechny reakční varianty v testu.

Inkubace bakteriální kultury s testovaným vzorkem

Do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek, obsahujících 5 µl vzorku pipetujeme 260 µl inokula, 660 μl sterilní H₂O a 75 μl 10x TGA. Nezbytnou součástí testu je také negativní kontrola, pozitivní kontrola a blank. Do blanku je namísto reakční směsi přidáno TGA médium. Schéma obsahu jednotlivých variant je uvedeno níže:

Tabulka 10: Složení reakčních směsí v negativní kontrole (NK), pozitivní kontrole (PK), blanku a samotném vzorku pro UmuC test.

Jako pozitivní kontrola byl použit 4nitroquinoline1oxide (4NQO). PK1 o koncentraci c = 0,078 μg.ml¹ a PK2 o koncentraci c = 0,156 μg.ml¹.

Po důkladném promíchání obsahu Ependorf mikrozkumavek rozpipetujeme jejich obsah po 250 μl do jamek na mikrodestičce ve třech opakováních. Mikrodestičku A proměříme v readeru při 600 nm (měření č. 1) a poté ji vložíme do inkubátoru a inkubujeme 4 h, 37 °C, 120 r.p.m. Po ukončení inkubace proměříme mikrodestičku opět při 600 nm (měření č. 2).

Příprava referenčních roztoků

Během inkubace připravíme roztok ONPG/CPRG asi 2 hodiny před jeho použitím a neustále jej uchováváme ve tmě. Dále připravíme mikrodestičku B s Bpufrem pro ONPG/CPRG (pipetujeme 100 µl do každé jamky), kterou předinkubujeme 30 minut při 28 °C.

Inkubace v referenčních roztocích

Po čtyřhodinové inkubaci (a jejím změření při 600 nm – měření č. 2) pipetujeme do desky B 25 µl z příslušné jamky na mikrodestičce A a 25 µl roztoku ONPG/CPRG.

Desku B změříme v mikrodestičkovém readeru při 420/570 nm (měření č. 3) a inkubujeme při teplotě 28 °C po dobu 30 minut. Po ukončení inkubace znovu změříme absorbanci při 420/570 nm (měření č. 4).

3. Zpracování výsledků

Výpočet nárůstu během inkubace (ΔD):

Kde A₆₀₀T_end je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm na konci inkubace, A₆₀₀BL_end je průměrná absorbance blanku při 600 nm na konci inkubace, A₆₀₀T_start je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm na začátku inkubace a A₆₀₀BL_start je průměrná absorbance v blanku při 600 nm na začátku inkubace. Pokud všechny výsledné hodnoty nárůstu ΔD jsou kladné, můžeme říci, že testovaná látka neinhibuje kriticky buněčné dělení.

Výpočet růstového faktoru (G):

Kde A₆₀₀T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm:

A₆₀₀BL je průměrná absorbance blanku při 600 nm:

A₆₀₀NK je průměrná absorbance negativní kontroly při 600 nm:

Odečet hodnot:

Z naměřených hodnot A₄₂₀/A₅₇₀ v čase t = 0 (měření č. 3) a t = 30 (měření č. 4) vypočítáme tyto hodnoty:

Tyto hodnoty použijeme při výpočtu IR a UT.

Výpočet IR (Induction Rate):

Pro ONPG:

Kde A₄₂₀T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 420 nm. A₄₂₀BL je průměrná absorbance v blanku při 420 nm. A₄₂₀NK je průměrná absorbance v negativní kontrole při 420 nm.

Pro CPRG:

Kde A₅₇₀T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 570 nm. A₅₇₀BL je průměrná absorbance v blanku při 570 nm. A₅₇₀NK je průměrná absorbance v negativní kontrole při 570 nm.

Jeli IR u nejkoncentrovanějšího vzorku < 1,5 lze jej počítat za výsledek.

Aktivita βgalaktosidázy:

Pro ONPG:

Kde A₄₂₀T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 420 nm, A₄₂₀BL je průměrná absorbance v blanku při 420 nm, A₆₀₀T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm a A₆₀₀NK je průměrná absorbance blanku při 600 nm.

Pro CPRG:

Kde A₅₇₀T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 570 nm, A₅₇₀BL je průměrná absorbance v blanku při 570 nm, A₆₀₀T je průměrná absorbance v testovaných jamkách při 600 nm a A₆₀₀NK je průměrná absorbance blanku při 600 nm.

4. Validace testu

Jestliže některá z koncentrací testovaných látek vykáže ΔD < 0, tzn. působí cytotoxicky, je nutné přehodnotit zvolené koncentrace a popřípadě je snížit. Výsledek testu lze považovat za platný, jestliže v referenčních jamkách je IR alespoň 2 za daných podmínek. Jeli G < 0,5, výsledek je neplatný.

Testovaná látka je považována za mutagenní, jestliže IR > 1,5.

2.