50
Mikroskop ansiklopedisi
Doç. Dr. Sait ŞEN; Ege Üniversitesi Tıp Fak. Patoloji AD.
Patoloji pratiğinde basit öğrenci mikroskoplarından başlayıp, her türlü uygulamayı
yapabilecek araştırma mikroskoplarına kadar uzanan eski veya yeni, oldukça geniş bir
mikroskop jenerasyonu bulunmaktadır. Burada rutin patoloji laboratuvarında bulunabilecek
özelliklerdeki bir araştırma mikroskopu üzerinde mikroskopa ait temel yapılar ve
mikrofotografik uygulama özellikleri ile gelişmiş önemli mikroskoplar ve uygulamalar
özetlenecektir.
Genel olarak mikroskop, mekanik ve optik bölüm olmak üzere iki ana bölüm içermektedir.
Mekanik bölüm
Mikroskopta ana gövdeyi oluşturan ve optik bölüm elemanlarını taşıyan kısımdır. Bu
bölümde gövde, mikroskop ayağı, obje tablası, şaryo, makro ve mikro vida düzeneği yer
almaktadır. Araştırma mikroskoplarının çoğunluğunda bazı şekil değişiklikleriyle bu yapı
korunmaktadır.
Gövde;
mikroskopun bütün mekanik ve optik elemanlarını taşıyacak sağlamlık ve biçimdedir,
gereğinde mikroskoba eklenebilecek mikrofotografi veya diğer aygıtları taşıyabilir.
Mikroskop ayağı:
Gövde ile birlikte diğer mikroskop bölümlerini üzerinde taşıyan kısımdır. Modern
mikroskoplarda ışık kaynağı ve bundan gelecek ışınların kondansöre iletilmesini sağlayacak
optik elemanları içine alabilecek biçimde bir yapı kazanmıştır ve gövde ile birlikte
değerlendirilebilir.
Obje tablası:
Mikroskopik preparatların kalaylıkla yerleştirilmesi ve izlenebilmesi için genelde geniş ve
dikdörtgen biçimde yapılmaktadır. Tek veya iki preparat alabilir. Tabla içine gömülü şaryo
sistemi, preparatın objektif önünde son derece duyarlı bir şekilde sağa-sola ve aşağı-yukarı
hareketini sağlar. Şaryo hareket vidalarıda elin kolayca ulaşabileceği bir biçimde sağa veya
sola yerleştirilebilir. Modern motorize mikroskoplarda şaryo elektronik kontrollü ve motorize
olabilir, bilgisayar tarafından kontrol edilebilir.
Makro ve mikro (kaba-ince ayar) vida düzenekleri;
Preparatta gözlenen mikroskopik alanın netliğini sağlamak üzere, obje tabasına kaba (makro)
ve ince (mikro) hareket yaptıran bir vida düzeneğini oluşturmaktadır. Gelişmiş araştırma
mikroskobu ve fotografi mikroskoplarında ayarlar elektronik kontrollü motorize olabilir ve
fokus yapılabilir.
51
Optik bölüm
Mikroskopun optik bölümünde; oküler, oküler tüpleri, objektif, kondansör ve ışık kaynağı yer
almaktadır.
Oküler;
Optik sistemdeki görevi, objektif ile koordine çalışır ve objektif tarafından oluşturulan ara
görüntüyü kendi büyültme oranı kadar büyülterek göze ulaştırmaktır.
Oküler üzerindeki büyültme gücünü (X6.3, 10, 15, 20, 30), görüş çapını belirleyen rakamlar
(18, 20, 22, 26.5) ile bazı tanımlayıcı harfler (UW, SWF) bulunur. UW veya UWF, “Ultra
Wide - Ultra Wide-Field” ultra geniş alan benzer şekilde WF “ Wide-Field” genil alan , SW
yada SWF “Super Wide-Field” super geniş alanı gösterir. H, HE yada “High Eyepoint”
okülerin
gözlükle
kullanılabileceğini
gösterir.
CF
CF
düzeltmeli
objektiflerle
kullanılabileceğini gösterir. Genel olarak okülerlerden birinde diyoptri ayarı yapmaya olanak
sağlayan bir mekanizmada eşlik eder. Okülerlerden gözün uzaklığını belirleyen ve oda
ışığının yansımasını engelleyecek bir lastik çerçevede bulunur.
Mikroskopta kullanılacak oküler, kullanılan objektifin türüne uyacak şekilde seçilmelidir.
Mikroskopik incelemelerde Apokromat ve Plan objektiflerle birlikte mutlaka Plan-Kompens
(PK) tipi okülerler kullanmak gereklidir. Aksi halde görüntünün renk ve görüntü kusurları tam
olarak düzeltilemez.
Tüp:
Tüp klasik olarak monooküler eski mikroskoplarda belirlenebilir, okülerin devamını oluşturur
içinde sanal imaj oluşur. Modern mikroskopların çoğunda, iki gözle bakmaya olanak verecek
şekilde “binoküler” özellikte, bazılarında fotoğraf kamerası eklenebilmek üzere bir fotoğraf
tüpü “trinoküler”, tüp sistemine eklenir bu yapıya dahil edilerek sonlanmaktadır. Trinoküler
sistemlerde fotoğraf bölümüne görüntü iletimi prizmalar ile kontrol edilerek devreye
alınmakta ve/veya farklı oranlarda ışık dağıtılabilmektedir.
Eğitim ataşmanları eklenecekse bu arada sisteme uygun şekilde eklenir ve görüntü dağıtımı
yapılabilir. Bir mikroskopta yan görüntü dağıtımları ile gözlemci sayısı 21 kişiye kadar
yükselebilir. Bu sırada işaretleme için ok sistemide devreye girmektedir.
52
Objektif:
Mikroskopun optik bölümü içerisinde en önemli kısımdır. Mikroskopik objeyi büyültme gücü
oranında büyülterek ara görüntüyü oluşturur, tüp yoluyla okülere görüntü iletilir. Bir
mikroskopun büyütme gücü, objektifin büyültme gücü ile okülerin büyültme gücü çarpımı
kadardır.
Mikroskoplarda görüntü kalitesi üzerinde birinci etken objektifin optik yapısıdır.
Mikroskoplarda kullanılan objektifleri optik yapısı bakımından; a) Akromat, b) Apokromat,
c) Plan apokromat d) flörit objektiler olarak ayırdedebiliriz.
Akromat objektifler: Genelde basit öğrenci mikroskopları ve rutinde kullanılan bazı
mikroskoplarda akromat objektifler bulunmaktadır. Bunlar, görüntü kusuru yönünden
düzeltilmemiş, renk kusuru yönünden de yalnızca sarı-yeşil renge göre çok iyi düzeltilmiş
objektif grubunu oluştururlar.
Plan objektifler: Karakteristik bir mercek kusuru olarak görüntü alanının bükülmesi lenslerde
ortaya çıkmaktadır. Yani merkez netleştirildiğinde kenarları net olmamakta, aksine kenarları
net yapıldığı zamanda da merkez net olmamaktadır. Bu görüntü kusuru, özel optik yapı
değişiklikleriyle ortadan kaldırılarak Plan objektif serisi oluşturulmuştur. Plan objektifler
renksel kusurlarının düzeltilmesi durumuna göre, Planakromat, Planfluorit ve Planapokromat
yapısında olabilirler.
Fluorit sistem: Bu objektif tipi renksel kusurları çok iyi düzeltmeyi sağlayan bir optik yapı
içermektedir. Son yıllarda bu objektifler çok iyi geliştirilmiş, özellikle mikrofotografide ve
Fluoresan mikroskopide yaygın olarak kullanılmışlardır.
Objektiflerin adlandırılmalarıda üzerlerine yazılan kısaltmalarla yapılmaktadır. Fluorit
objektifler “FL”, Apokromat objektifler “Apo”, Plan objektiflerde “Plan” veya “Pl”
kısaltmalarıyla gösterilirler.
Bunlardan başka her objektifin üzerinde, objektifin büyültme gücü, apertür açıklığı, tübus
uzunluğu ve lamel kullanımına ilişkin rakamlar, renkler yer almaktadır.
53
Kondansör;
Optik sistemde ışık kaynağından gelen ışığı preparat üzerine homojen olarak dağıtan, yapısına
göre değişik aydınlatma yöntemlerinin uygulanmasına olanak veren bir optik sistemdir. Optik
özelliklerine göre : a) Basit kondansörler, b) Aplanatik kondansörler, c) Aplanatik-Akromatik
kondansörler, d) Faz kontrast kondansörleri, e) Karanlık alan kondansörleri olarak ayrılırlar.
Basit
kondansörler:
çoğunlukla
iki
mercekli
olup
renk
kusurları
yönünden
düzeltilmemişlerdir. Daha çok basit öğrenci mikroskoplarında kullanılırlar.
Aplanatik kondansörler: Mercek yapısı nedeniyle daha iyi kalitede bir aydınlatma sağlarlar.
Renksel kusurları orta derecede düzeltilmiştir.
Aplanatik-Akromatik kondansörler: Optik aydınlatma yönünden çok iyi gelişmiş mercek
sistemi ile renk kusurları yönünden tamamen düzeltilmişlerdir.
Faz kontrast kondansörleri: Optik yapısı bakımandan Aplanatik-Akromatik yapıdadır. Ayrıca
kondansörün içine her objektif için ayrı ayrı, bir eksen etrafında dönecek biçimde
54
düzenlenmiş faz halkaları yerleştirilmiştir. Faz kontrast kondansörü ile beraber mikroskopa
özel faz kontrast objektifleri takılarak faz kontrast çalışma yapılabilmektedir. Faz kontrast
objektifleri içinde de her objektife özgü ayrı ayrı faz halkaları vardır. Hangi büyütmeli
objektif kullanılıyorsa kondansörde o objektife uygun faz halkası optik eksene getirilir. Faz
kontrast çalışmanın temeli, boyanmamış preparatlarda objede bulunan yoğunluk farklarını faz
farklarına dönüştürerek objenin değişik bölgelerini farkla yoğunluklarda göstermeye
dayanmaktadır. Bu yöntemle özellikle canlı doku ve hücre örnekleri zarar görmeden hücre
ayrıntıları yönünden çok daha iyi incelenebilmektedir.
Karanlık alan kondansörü: Kondansörün optik yapısı nedeniyle ışık kaynağından gelen
ışık, kondansör içindeki belirli yüzeylerden yansıyarak objeye belli bir açıda ışığın girmesine
neden olur. Bu sistemde objedeki yapılardan yansımayan hiç bir ışık objektif görüş alanına
giremez. Karanlık alan kondasörleri kuru ve yağlı olmak üzere iki tiptir. Kuru tipte kondasör
ile preparat arasında ışık iletici herhangi bir ortama gerek yoktur. Yağlı karanlık alan
kondansöründe ise, kondansör üst merceği ve preparatın alt yüzü arasında ışık iletimi için
immersiyon yağı veya gliserin kullanılmaktadır.
Işık kaynağı:
Gerek mikroskopik aydınlatma gerekse mikrofotografide oldukça önemli bir bölümü
oluşturmaktadır. Bugünkü modern mikroskoplarda aydınlatmada ışık kaynağı olarak
çoğunlukla düşük voltajlı yüksek ışık güçlü halojen lambalar kullanılmaktadır. Normal
mikroskopik aydınlatmada kullanılan 6 Volt 20-30 Watt lambalar, araştırma mikroskoplarında
yerini 12 Volt 100 Watt Halojen lamabalara bırakır. Mikroskopik aydınlatmada bu lambalar
görünür ışık dalga bandındaki çalışmalarda kullanılmaktadır. Işık mikroskobik aydınlatmada
led ampüllerde kullanıma girmiştir. Gövde üzerinde ışık şiddetini ayarlayan reosta ve açma
kapama düğmesi yer alır.
Ultraviole dalga boyunda ışınların kullanıldığı fluoresan mikroskopide ise, güçlü ışın veren
civa buharlı yüksek basınç altında hazırlanmış
değişik güçlerde
özel lambalar
kullanılmaktadır. Bunlar, üreten firmanın kendine özgü kısaltılmış simge ve rakamlarıyla
belirtilmektedir. Bunlara HBO 50, HBO 100, gibi lambalar örnek verilebilir. Flöresan
incelemede kullanılan ışığın dalga boyları 313, 334, 365, 406, 435, 546 ve 578nm dir ve özel
filtreler bu amaca uygun olarak seçilir. Yeni uygulama olarak flöresan aydınlatmada spesifik
dalga boylu led ampüllerde kullanılmaya başlanmıştır. Zeiss in Colibri sisteminde aynı anda
birden fazla led ışık ile farklı dalga boylarında aydınlatma ile çalışmak olasıdır.
halojen lamba
civa arklı lamba
ksenon arklı lamba
Ksenon lambalar oldukça parlak ışığa ihtiyaç duyulan yansıtmalı “reflekted” mikroskobide
tercih edilir. Halojen lambadan parlak iken civalı lambaların yoğunluk pikine ulaşamamakla
flöresan mikroskobide kullanılabilir.
55
Mikroskopta aydınlatma yöntemleri:
Değişik bilim dallarında kullanılan mikroskoplarda, mikroskopta incelenen objenin özelliğine
göre, özel aydınlatmalar sağlayacak yapısal değişiklikler görülmektedir. Biyoloji ve tıbbın
değişik alanlarında kullanılan mikroskoplarda genel olarak alttan (içten – geçirgen –
transmitted) ve üstten (yansıtmalı- reflected) aydınlatma yapabilecek bir optik yapı
bulunmaktadır.
geçirgen görüntüleme
yansıtmalı görüntüleme
Bir araştırma mikroskobunda aynı anda hem görünür ışık dalga boyunda alttan aydınlatma ve
flöresan ışıkla üstten aydınlatma yapılabilmektedir.
Biyolojinin bazı alanlarında, örneğin botanik, zooloji ve paleobotanikte, objelerin dış yüzeyini
incelemek üzere üstten aydınlatmada kullanılabilecek ışık yansıtmalı (reflected-light)
objektifler geliştirilmiştir. Bunlarda objeyi aydınlatacak ışık, tübus ve objektif içindeki özel
ayna yüzeylerden yansıtılarak obje yüzeyine ulaşmakta, aydınlatılmış obje yüzeyinden elde
edilen görüntüde ortadaki objektif tarafından okülere iletilmektedir. Üstten aydınlatmada bir
diğer aydınlatma tipi, özellikle ışık geçirmeyen objelerin incelenmesinde metalurji ve
mineraloji bilim dallarında kullanılmaktadır. Bu dallarda kullanılan mikroskoplarda üstten
aydınlatmada ışık yolu resim’de gösterilmiştir. Burada, objektif-oküler eksenine eklenen bir
yarı geçirgen prizma ile preparatın aydınlatılması ve preparattan gelen görüntünün
incelenmesi doğrudan doğruya objektif içerisinden yapılmaktadır.
Patolojide özel mikroskobi uygulamaları
Patoloji uygulamaları genelde parlak-aydınlık saha ve geçirgen ışıkla, ve farklı boyama
yöntemleri ile yapılmaktadır. Bir çok uygulamada doku bütünlüğü bozulmadan ve boyama
yapılmadan değerlendirme de gerekebilmektedir. Bu durumlarda özel mikroskobi
uygulamaları yapılamaktadır. Bunlara örnek olarak ışığın üsten uygulandığı reflected
mikroskobi ve/veya karanlık saha uygulamalar ile ultraviyole ışıklarla görüntüleme örnek
verilebilir.
Flöresan mikroskobi
Civa veya ksenon arklı güçlü ışık kaynakları ile mümkün olur. Özel filtreler yardımı ile belli
dalga boyunda aydınlatılan doğal yada yapay olarak boyanmış flöresan ışık veren maddeler
incelenir. Siyah zeminde flöresan veren yapılar değerlendirilir.
56
Genelde reflected- yansıtmalı teknik kullanılır. Civa arklı lambanın belli bir dalga boyundaki
ışığı araştırılan doku üzerine yönlendirilir. Bu ışıkta renk veren otoflöresan veya boyalı
maddeler siyah zeminde flöresans verir. Burada basit olarak FITC ile işaretli monoklonal
antikorlar kullanılabileceği gibi digital fotografi yardımıyla üstü üste bindirilen fotograflarla
farklı filtre setleri kullanılarak çoklu flöresan boyama (FİSH) yapılabilir. Özel flörid
objektifler kullanılması daha uygundur.
Flöresan mikroskobide dalga boyları. FITC boyamada, mavi olarak gelen UV ışık, yeşil refle
olarak okülerden göze yansır.
Karanlık saha mikroskobisi
Özel kondansör ve objektiflere ihtiyaç duyar, ışık alttan veya reflected olarak üstten
uygulanabilir. Reflekted karanlık sahada objektifler LWD
(Long Working Distance),
uzun çalışma
mesafesi ULWD ve ELWD
(Ultra-Long Working Distance), (Extra-Long Working Distance)
olarak belirlenir.
57
Polarizasyon mikroskobi
Rutin parlak saha ışık mikroskobisindeki polarizasyon mikroskobunda polarizör ve analizör
olmak üzere iki filtre bulunur ve ışık patikasına yerleştirilir. Polarizör tablanın altında ışık
kaynağının üstünde bulunur, 360 derece döndürülme imkanı vardır, soldan sağa veya doğu
batı yönünde vibrasyona izin verir. Analizör ise genellikle kuzey güney yönde düzenlenmiştir
ve objektifin üzerinde bulunur. Bazı sistemlerde analizörde döndürülebilir. Kullanılmadığında
ışık patikasından çıkarılabilir. Özellikle amiloid birikimlerinin Kongo kırmızısı boyamasında
elma yeşili refle vermesinde önem taşır. Ayrıca dokudaki kristaller polarizasyon ile çok kolay
tanınabilir.
Işık mikroskobu için polarizör ve analizörden oluşan polizasyon filtreleri ile basit ara parça
Mikrofoto sistemleri
Günümüzde mikrofotografi sistemleri, değişik üreticilerin üretmiş oldukları mikroskoplara
eklenebilen, basitten yüksek çözünürlük ve hıza kadar değişen özelliklerde digital
makinalardan oluşmaktadır. Bazıları görüntüyü üzerindeki belleğe aktaran digital fotograf
makinaları iken, bazıları yanında kontrol ve depolama için bilgisayara ihtiyaç duyan
kameralardan oluşur.
Digital fotografinin gelişimi ile fotograf çekmek çok kolaylaşmıştır. Bu makinalarda klasik
fotografide karşımıza çıkan film seçimi, pozlandırma süre ve ayarları tam otomatik olarak
yapılmaktadır. Kullanılan makinalar günlük hayatta kullanılan digital fotograf makinaların
mikroskoba uyarlanan şekilleri olabilir. Bu durumda özel ara adaptörler ve özel mikroskop
ayarları gerekecektir. Ancak son zamanlarda özel digital kameralar, ara ekipmanlar (depolama
ve görüntüleme için) yada bilgisayar kullanımı daha ön plandadır. Bu sistemlerden doğrudan
barkovizyon veya televizyon gibi cihazlara direkt aktarım da mümkün olabilmektedir.
Bu görüntüler telekonferans ve konsultasyon için kullanılabilir. Bazı özel yazılım ve
mikroskoplar ile konferansa katılanlar ve değerlendiriciler mikroskoba uzaktan kumanda
edebilirler.
Sanal mikroskobi
Özel yapılmış mikroskoplar ve kamera sistemleri ile preparatlar taranır ve bilgisayar ortamına
aktarılır. Depolanan görüntü özel programlarla bilgisayar ekranı üzerinde, mikroskopta
olduğu gibi dolaşıp, büyütülerek incelenir. Kongrelerde ve bazı dergilerdeki olgu sunumları,
konsultasyonlar ve çok merkezli çalışmalar bu şekilde yapılabilmektedir. Gelecekte öğrenci,
asistanların eğitim arşivlerinin bu şekilde oluşturulması ve internet ile eğitim, sınavların
58
bilgisayar üzerinden gerçekleştirilmesi olası olacaktır. Daha ütopik olarak laboratuvar
dışından preparatlarımıza ulaşma ve tanı koyma imkanına sahip olabileceğiz.
Bu araçlar mikroskop üreticilerin kendi ortaklıkları veya geliştirdikleri sistemler (Nikon-
aperio, Olimpus-dotslide) ile yürümektedir. Mikroskop firmaları kendilerini bu şekilde
geleceğe hazırlamakta, mikroskopa alternatif olarak sunmaktadır. Bu konudaki örnek
uygulamalar
http://www.patoloji.med.ege.edu.tr/nepathol/sanal%20mikroskobi.html
internet
adresinde gösterilmiştir. Dokuz Eylül Üniversitesi öğrenci eğitiminde kendi sistemini
kullanmaktadır.
http://194.27.56.209/mirax/
. Burada bir preparatın görüntüsü, doku boyutu
yanısıra tarama çözünürlüğü, ve sistemne göre değişmekte olup 40 GB’a ulaşabilmektedir.
Tarama süresi ise 2 dakikalara kadar inmiştir.
Elektron mikroskobi,
Elektron mikroskop örneğin elektronik olarak büyütülmüş görüntüsünü oluşturan bir
mikroskop tipidir. Örneği görüntülemek için elektron partiküllerini kullanır ve büyütülmüş
görüntü oluşturur. Optik ışık mikroskobuna göre görülebilir (foton) dalga boyu 100,000 kez
küçük olduğundan 1,000,000 kat büyük görüntü oluşturabilir, optik mikroskobun büyütmesi
ise 2,000 kat ile sınırlıdır. Görüntü oluştururken, elektron akımını kontrol etmek ve
odaklamak için elektrostatik ve elektromagnetik “lens”ler kullanır.
Optik mikroskop kalitesinde olan ilk elektron mikroskop 1933 te Ernst Ruska tarafından
oluşturuldu. Patent ise 1931 yılında Siemens tarafından alınmıştı, Rutka 1937 yılında Siemens
ile çalışmaya başladı, 1939 da ilk ticari geçirgen elektron mikroskop (Transmission Electron
Microscope (TEM)) ortaya çıktı
Transmisyon elektron mikroskop; Yüksek voltajlı elektron akımı imaj oluşturmak için
kullanılır, Elektron tabancası elektronları yayar, elktron kaynağı tungsten Flamanlı bir
katoddur. Elektron ışınları +100 keV (40 to 400 keV) anod ile hızlandırılır, elktrostatik ve
elektromagnetik lensler ile odaklanır ve incelenecek örneğin içinden geçer. Dışarı çıkan
ışınlar mikroskopun objektif lens sistemiyle büyütülür ve bu bilgi flöresan görüntüleme
ekranına aktarılır. Görüntü olarak değişik ortamlarda depolanır. CCD kamera ile yakalanan
görüntüler bilgisayar veya monitorlerde görüntülenebilir. TEM görüntülerde de sferik
aberrayonlar sınırlayıcıdır, yeni jenerasyon düzelticiler ile bu düzeltilip rezolüsyon
artırılmıştır. Yüksek rezolüsyonlu TEM’lerde (High Resolution TEM HRTEM) rezolüsyon
0,5 Angstrom (50 picometre) altına inmiştir (50 milyon büyütme).
Taramalı elektron nikroskop (Scanning electron microscope (SEM)) TEM’den farklı
olarak SEM’in elektron ışınları örneğin tam görüntü bilgisini içermez. Örnek dört tarfından
elektron ışınları ile taranır ve örneğin her köşesinde elektron demetleri enerji kaybeder ve
kayıp enerji ısı, ışık, elektronlara sekonder düşük enerji, veya x ışınına çevrilir. Örnekte
enerjinin oluştuğu bölüme göre bu sinyallerin yoğunluğunun görüntüsü SEM görüntüsünü
oluşturur. Genel olarak SEM imaj kalitesi TEM’e göre düşüktür. SEM görüntüsü örneğin
yüzeyini gösterir.
KAYNAKLAR
1.
http://www.zeiss.de/C1256B5E0047FF3F/?Open
2.
http://www.microscopy.olympus.eu/microscopes/About_Microscopy_7436.htm
3.
http://olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.html
4.
http://194.27.56.209/mirax/
5.
http://www.patoloji.med.ege.edu.tr/nepathol/sanal%20mikroskobi.html
6.
http://www.path.uiowa.edu/virtualslidebox/
Dostları ilə paylaş: |