Resolving kir genotypes and Haplotypes Simultaneously Using Single Molecule, Real-Time Sequencing

---

For Research Use Only. Not for use in diagnostics procedures. © Copyright 2016 by Pacific Biosciences of California, Inc. All rights reserved. Pacific Biosciences, the Pacific Biosciences logo, PacBio, SMRT, SMRTbell, Iso-Seq, and Sequel are trademarks of Pacific Biosciences. 

BluePippin and SageELF are trademarks of Sage Science. NGS-go and NGSengine are trademarks of GenDx. All other trademarks are the sole property of their respective owners.

Resolving KIR Genotypes and Haplotypes Simultaneously 

Using Single Molecule, Real-Time Sequencing

Ekholm, J.M.

1

, Pyo, C.W.

2

, Eng, K.

1

, Hall, R.

1

, Vierra-Green, C.

4

, Spellman, S.

4

, Roe, D.

3 

, Geraghty, D.E.

2

, 

Maiers, M.

3

, Ranade, S

1

1

PacBio, 1380 Willow Road, Menlo Park, CA  94025, 

2

Clinical Research Division, Fred 

Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA, 

3

National Marrow Donor Program, Minneapolis, MN USA, 

4

Center for International Blood and Marrow Transplant Research, Minneapolis, MN USA

Introduction

Complex Organization of KIR 

Haplotypes

Method II: NimbleGen SeqCap

Target Enrichment 

Conclusions

The killer immunoglobulin-like 

receptors (KIR) genes belong to the 

immunoglobulin superfamily and are 

widely studied due to  the critical role 

they play in coordinating the innate 

immune response to infection and 

disease.  KIR gene clusters are found 

on chromosome 19q13.4, in a span of 

~150 kb region. The content of these 

clusters  varies in number and type of 

gene alleles based on linkage 

disequilibrium and determines each 

haplotype as  A (inhibitory) or B 

(activating)

1)

. Thus resolving individual 

genotypes of members of the KIR gene 

clusters, within and between the 

haplotypes of a given individual is 

important for biological interpretations 

of its function, phenotype, and disease.

Current genome-wide analysis 

methods or PCR based approaches for 

genotyping KIR genes in population 

studies, have been limited in their 

ability to acquire phased, extended, 

and complete genomic sequences that 

are long enough to assemble 

haplotypes with high confidence. Highly 

accurate, contiguous, long reads, like 

those generated by SMRT Sequencing, 

when combined with target-enrichment 

protocols, provide a straightforward 

strategy for generating complete de 

novo assembled KIR haplotypes. We 

have explored two different methods to 

capture the KIR region; one applying 

the use of fosmid clones and one using 

Nimblegen capture. 

Figure 1. Polymorphic Gene Content of KIR 

Haplotypes: Gene Deletion, Insertions, and 

Hybridizations (CNVs)  

Figure 2. Recombineering approach for target enrichment 

of fosmids to capture haplotypes of interesting 

loci from a human genome in a tiling approach. 

SMRTbell

™ 

ligation

PacBio

®

RS II 

Sequencing

Pooled 

fosmids

Restriction 

linearize

Trim 

vector 

sequence

Overlap

Error correct the reads 

containing full-length fosmid

sequence using all continuous 

long reads

Trim the vector sequence from 

the corrected reads and 

overlap the fosmids, forming a 

draft haplotype sequence

Quiver consensus

Polish using the Quiver algorithm generating a highly accurate haplotype 

sequence 

Figure 3. Workflow for SMRT

®

Sequencing of a full-

length fosmid library preparation from a pool 

of fosmids belonging to a single haplotype or 

both haplotypes enriched from targeted 

regions of interest from genomic DNA and an 

automated DNA analysis pipeline.

Figure 4. Recombineering-based method for isolating a 

tiling of targeted fosmids (

∼35 kb –

50 kb)

3

was combined with SMRT Sequencing. 16 

haplotypes assembled from 8 individuals 

(available in NCBI). Partial reference, 

available for homozygous sample 0071-9105 

was 100%  concordant with PacBio assembly.

Figure 6.  A. Known Haplotypes

B. Coverage showing alignment of captured 

reads >8.5 kb against the known reference 

haplotypes

C. Coverage of >8.5 kb reads against known 

haplotypes when data is aligned against all 

known full-length KIR sequences

D. De novo assembled phased sequence, red 

indicates assembly error that results in a 

contig of mixed phase

A

B

C

D

•

SMRT Sequencing generated highly 

accurate long reads necessary for 

simultaneous genotyping and 

haplotyping of complex KIR regions

•

SMRT Sequencing of target-enriched 

fosmids provided >35-50 kb 

contiguous sequences for improving/ 

establishing reference database with 

imputation-free information

•

NimbleGen SeqCap, a scalable 

alternative, validated known KIR 

haplotypes of a known sample in a 

reference guided assembly of 5-8 kb 

enriched DNA

Figure 5.  Barcoding options for targeted sequencing. 

www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/ProductNote-

Barcoded-Adapters-Barcoded-Universal-Primers.pdf

A. Barcoded Universal Primers: Barcode can be 

incorporated into the amplicon via a two-step tailed 

primer approach.  Barcodes are commercially 

available from PacBio.

B. Barcoded Adapters: Barcodes are incorporated during 

ligation with barcoded adapters.  Barcodes are 

commercially available from PacBio. 

C. Locus-specific primers tailed with barcodes.  Primers 

may be ordered from any oligo synthesis providers. 

The first 96 barcodes out of 384 sequences are 

available: 

www.pacb.com/wp-content/uploads/PacBio-PCR-

Primer-Barcodes- 0001-to-0096-IDT-Template.xlsx

.  

Method I: Fosmid Sequencing

References

1)

Uhrberg M, Valiante N M, Shum B P, Shilling H G, Lienert-

Weidenbach K, Corliss B, Tyan D, Lanier L L, Parham P. Human 

diversity in killer cell inhibitory receptor genes. Immunity. 1997;7:753. 

[

PubMed: 9430221

]