The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

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Chapter I 
N-terminus  (Trp  α43  to  Ser  α53)  showed  involvement  in  small  molecule  binding 
(unpublished data). Furthermore, J10 and its derivatives show activity on all tested DR 
alleles  (DR1,  DR2,  DR4)  indicating  they  might  bind  to  the  non-polymorphic  DRα 
chain. As this region is also known to be involved in DM binding and activity (Doebele 
et  al.,  2000)  it  is  possible  that  the  small  molecule  and  DM  might  target  similar 
MHC II/peptide  interactions.  However,  unfortunately,  the  extra  electron  density  could 
not unambiguously be accounted for by the small molecule. Reasons for the absence of 
well-defined  density  for  the small molecule  could be  partial occupancy  of the binding 
site by the small molecule. It is also possible that the small molecule did not bind to the 
DR2 species which crystallized as it might bind to DR2 conformations only available if 
the  peptide  is  partially  released  which  has  been  seen  for  DM  recently  (Anders  et  al., 
2011).  As the MBP peptide is  a high-affinity peptide for DR2  this species might  have 
been  small  especially  as  the  peptide  was  still  covalently  linked  to  the  protein  which 
further increased peptide affinity.  In the  obtained  DR2  structure the MBP peptide was 
fully bound and showed no conformational changes. Unfortunately, crystals set up with 
DR2/MBP complex having the linker between peptide and DR2 cleaved did not provide 
data sets  with  sufficient  resolution, maybe  due to  higher flexibility.  For  another group 
of  MHC II  loading  enhancers  (di-peptides,  see  table  1.1,  (Gupta  et  al.,  2008))  some 
evidence  points  to  the  P1  pocket  as  a  possible  binding  site  although  a  co-crystal 
structure  has  not  been  determined,  yet.  It  is  possible  that  J10  might  bind  to  a  similar 
site,  for  which  partial  peptide  release  would  be  necessary.  In  the  future  co-
crystallization experiments with the small molecule could be performed using a MHC II 
molecule carrying a low-affinity peptide or even an N-terminally truncated peptide (see 
chapter  II).  Screening  new  crystallization  conditions  might  result  in  well  diffracting 
crystals  and  reveal  a  structure  presenting  a  partially  filled  peptide-binding  groove  or 
conformational changes upon small molecule binding.  
To investigate the effects of J10 and its derivatives on the dynamics of peptide bound 
to  MHC II  molecules 
1
H-
15
N  HSQC  spectra  of  triple-labeled  (
2
H, 
13
C, 
15
N)  MBP 
peptide  in  complex  with  DR2  were  measured  before  and  after  addition  of  the  small 
molecule  J10-1.  When  the  spectra  were  compared  no  obvious  chemical  shifts  of  the 
peaks were detected but several changes in peak intensities were observed which could 
indicate  peptide  changes  resulting  from  interactions  of  the  small  molecule  with  the 
MHC II/peptide complex. Furthermore, as there were more peaks (~ 29) than expected 
for a 15 amino acid long peptide and only three possible overlaps with the spectrum of 

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Chapter I 
the  free  peptide,  the  presence  of  multiple  distinct  conformations  of  the  bound  MBP 
peptide were observed. 
15
N-NOESY and HNCA experiments were performed with the 
sample  but  unfortunately  an  unambiguous  assignment  of  the  peaks  was  not  possible. 
Without  knowing  which  sets  of  peaks  belong  to  certain  peptide  conformations  it  was 
difficult to determine the C
α
 connectivity. With almost twice as many peaks as peptide 
residues  there  could  be  two  distinct  peptide  conformations  or  several  distinct 
conformations  for  particular  residues  or  peptide  segments.  But  even  without  a  distinct 
peak assignment the  NMR spectra show that  the MBP peptide  although it is  bound to 
the  DR2  molecule  exhibits  conformational  dynamics  with  several  distinct  peptide 
conformations  which  was  very  surprising,  especially  as  DR2/MBP  is  a  high-affinity 
complex.  So  far  the  structural  information  we  have  about  DR2/MBP  and 
MHC II/peptide  complexes  mostly  arises  from  crystal  structures  which  depict  the 
complex  in  a  low  energy  state.  The  crystal  structures  of  MHC II/peptide  complexes 
normally show one peptide conformation tightly bound to the MHC II molecule which 
is energetically very stable as it is stabilized by two main binding features: peptide side 
chains interact with pockets formed by the MHC II molecule and the peptide backbone 
forms a hydrogen bond network with conserved MHC II residues. In solution there are 
likely also more loosely bound peptide conformations present that are energetically less 
stable but still long-lived to be detected by NMR experiments. In the crystal structure of 
DR2/MBP (Smith et al., 1998) the C-terminus of the peptide exhibits an overall raised 
position  with  P7  and  P9  pockets  only  partially  occupied  indicating  this  part  of  the 
peptide  being  more  loosely  bound.  As  in  solution  the  complex  likely  exhibits  more 
flexibility  it  is  possible  that  multiple  distinct  conformations  of  the  peptide  C-terminus 
were observed by NMR. To further explore which parts of the peptide exhibit multiple 
conformations  a  definite  resonance  assignment  is  necessary  for  which  residue-specific 
labeling would be needed as  further triple resonance experiments  might  be difficult  to 
interpret.  
The  HSQC  spectrum  of the  triple  labeled  MBP  peptide  in  complex  with DR2  after 
addition  of  the  small  molecule  J10-1  showed  an  increase  of  peak  intensity  of  four 
stronger and two weaker peaks. This could be an effect of small molecule addition and 
could  indicate  that  the  small  molecule  increased  the  population  of  a  certain  peptide 
conformation. Furthermore, it is also possible that these specific resonances arose from 
residues  showing  increased  mobility  upon  small  molecule  addition  leading  also  to 
signal enhancement. Whether the observed changes are due to small molecule binding 

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