The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

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Chapter I 
has  to  be  further  investigated  and  similar  as  mentioned  above  without  a  definite  peak 
assignment it is not clear which part of the peptide could have been affected. In case the 
observed  changes  are  induced  by  small  molecule  binding  they  are  rather  subtle  as  no 
chemical shifts were observed.  
The 
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F-NMR  experiments  showed  that  the  small  molecule  J10-11  had  a  higher 
affinity  to  the  less  stable  complex  DR2/CLIP  than  to  the  more  stable  complex 
DR2/MBP  which  could  indicate  that  the  small  molecule  binds  to  an  intermediate 
MHC II/peptide  conformation.  Better  binding  to  low-  than  to  high-affinity 
MHC II/peptide complexes has been also seen for DM (Anders et al., 2011) showing an 
additional  similarity  between  both  molecules.  For  future  experiments  it  might  be 
interesting  to  use  a  lower  affinity  MHC II/peptide  complex  as  the  effect  of  the  small 
molecule  seen  by  NMR  might  be  more  pronounced.  But  on  the  other  hand  the  NMR 
spectra  might  become  even  more  complex  with  a  low-affinity  peptide  as  more 
intermediate peptide conformations might be observable.  
 
 

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46 
Chapter II 
3
 
Chapter  II:  Structural  effects  of  destabilizing  peptide-
MHC
 
II  interactions  and  implications  for  the  peptide 
exchange mechanism of HLA-DM 
3.1
 
Introduction 
Elucidating  the  molecular  basis  for  the  generation  of  ligands  presented  to  CD4+  T 
cells  requires  a  deeper  understanding  of  how  MHC II  molecules  are  loaded  with 
antigenic  peptides  catalyzed  by  DM.  Besides  susceptibility  to  proteolytic  cleavage 
resistance to DM catalyzed peptide release is a major factor in determining whether or 
not  a  particular  peptide  is  presented  on  the  cell  surface.  Therefore,  understanding  the 
mechanism  of  DM  mediated  peptide  loading  and  release  would  promote  efforts  to 
predict  immunogenicity  of  known  and  emerging  pathogens.  However,  the  molecular 
mechanism of DM catalysis is not well understood.  
The  co-crystal  structure  of  the  DR/DM  complex  would  expose  crucial  interacting 
residues  and  also  reveal  the  overall  conformation  both  proteins  adapt  in  the  complex, 
thus  shedding  light  on  the  mechanism  of  how  DM  catalyzes  peptide  exchange  of 
MHC II molecules. DM catalyzes exchange of peptides with various sequences (Weber 
et al., 1996) suggesting that DM might partially target MHC II-peptide interactions that 
are peptide sequence-independent. Recent studies have shown that release of the peptide 
N-terminus  of  the  peptide-binding  groove  of  MHC II  molecules  is  necessary  in  order 
for DM to bind DR molecules and catalyze peptide exchange  (Anders et  al., 2011). In 
particular,  disruption  of  the  four  N-terminal  conserved  hydrogen  bonds  and  release  of 
the peptide anchor residue from the P1 pocket seems to be necessary for DM binding. 
Taking this  new information into account,  a new approach was  designed  to  crystallize 
the  DR/DM  complex  using  a  modified  DR  molecule  missing  the  three  N-terminal 
peptide  residues  which  exhibited  higher  affinity  for  DM  than  DR  complexes  with  full 
length  peptide.  As  the  complex  was  not  covalently  linked  the  affinity  between  both 
molecules  had  to  be  optimized  to  favor  crystallization  of  the  complex  versus  the 
individual components. Therefore, surface plasmon resonance experiments were carried 
out  to  determine  the  dissociation  constant  of  the  complex  at  different  pH  to  direct 
crystallization screens.  

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47 
Chapter II 
Furthermore,  the  structure  of  the  DR1  molecule  carrying  an  N-terminally  truncated 
peptide  was  pursued,  as  the  implications  of  the  partial  peptide  release  for  the  DR1 
conformation were unknown. The structure of the modified DR1/peptide complex could 
indicate  whether  conformational  changes  occur  in  the  DR  region  around  the  missing 
peptide  N-terminus  or  whether  the  DR  conformation  is  stable,  even  if  the  N-terminal 
peptide residues are missing and several hydrogen bonds are not formed. Of particular 
interest  is  the  conformation  of  the  extended  strand  of  the  DRα  chain  around  residues 
Serα53  and  Pheα51,  which  is  adjacent  to  the  peptide  N-terminus  and  forms  an  anti-
parallel β-sheet with the peptide. This region includes residues shown to be involved in 
DM  activity  (Anders  et  al.,  2011;  Doebele  et  al.,  2000).  The  DR1  structure,  with  a 
partially filled peptide-binding groove, might  reveal a DM receptive DR  conformation 
giving  further  insight  into  the  process  of  peptide  exchange  by  MHC  II  molecules.  To 
prepare  DR1  complex  with  the  very  low-affinity  HA  peptide  variant,  the  peptide  is 
covalently linked to the DRα chain in the peptide-binding groove via a disulfide bond. 
However,  the  yield  of  complex  formation  was  very  low.  Since  large  amounts  of 
DR1/peptide  complex  are  needed  for  crystallization  experiments,  the  protocol  for  the 
peptide loading and covalent linkage reaction had to first be optimized.  
 
3.2
 
Materials and Methods 
3.2.1
 
Preparation of biotinylated HLA-DM and HLA-DM mutant 
Soluble  DM  and  DM  mutant  (DMα  R98A-R194A,  DM  mut),  which  shows  no 
binding  to  DR,  were  expressed  in  Sf9  insect  cells.  The  cells  were  infected  with 
recombinant  Baculovirus  (MOI  >  5)  and  proteins  purified  after  3  days.  Both  proteins 
carried a C-terminal BirA tag (GLNDIFEAQKIEWHE) at the α-chain and a protein C 
tag  at  the  ß-chain.  Two  N-linked  glycosylation  sites  (DMα  N165D  and  DMß  N92D) 
were  removed  to  diminish  heterogeneity  leaving  the  DMα  Asn15  glycosylation  site. 
Proteins  were  purified  by  anti-Protein  C  affinity  chromatography  (Roche  Applied 
Science) and aggregates were removed by gel filtration (Superose 6, GE Healthcare). 
BirA was added at a molar ratio of 1:20 (BirA:protein) for site-specific biotinylation 
of the BirA tag. The reaction was incubated for 2 h at 30 ºC at a protein concentration of 
2-3 mg/mL in the presence of biotin (100 μM), ATP (10 mM) and protease inhibitors. 

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