$-Amyloid

3. Molecular Biological Analyses 
 
1) Detection of Periodontal Bacteria
 
 
The  bacterial  flora  in  human  dental  plaque  is  diverse  and  complex,  consisting  of  more 
than  700  bacterial  species,  whereas  a  small  subset  of  the  species  is  considered  to  be  the 
primary  agents  of  periodontal  diseases  [34-38].  The  periodontal  pathogens  generally  belong 
to the obligate anaerobe group, and isolation of these species is technically very demanding 
and  time-consuming.  On  the  other  hand,  the  recent  development  of  molecular  biological 
techniques enables the analysis of the periodontitis-related species without bacterial isolation. 
The  PCR  technique  using  the  bacterial  DNA  extracted  from  the  specimens  can  identify  the 
bacteria  with  species-specific  sets  of  primers  [39-43],  whereas  the  disadvantage  of  this 
approach  is  that  only  selected  species  can  be  analyzed.  In  contrast,  broad-range  PCR  and 
sequence  methods  can  demonstrate  the  bacterial  profiles  in  the  specimens  since  the  primers 
are designed for the common region of the 16S rRNA sequences for eubacterial species [44, 
45]. The advantage of this method is that it can identify any species registered in the genomic 
databasesbut it takes more time and is relatively expensive compared to the conventional PCR 
method. In addition, a quantitative PCR method can be used to determine the bacterial levels 
in  the  specimens  [46].  Although  it  would  be  valuable  to  determine  the  numbers  of  each 
species  in  the  specimens,  it  would  be  relatively  expensive  to  do  so  at  present  with  large 
numbers of specimens in large-scale clinical studies.  
It  is  also  important  to  decide  whether  saliva  or  dental  plaque  specimens  are  to  be 
analyzed  when  using  these  techniques.  Whole  saliva  specimens  generally  reflect  the  entire 
bacterial  profiles  in  the  oral  cavity,  whereas  the  profiles  of  the  dental  plaque  specimens  are 

---

Periodontal Diseases in Children and Adolescents … 
47 
limited  to  those  of  the  collected  area.  Thus,  we  must  carefully  consider  which  specimens 
match the purpose of studies prior to their initiation. In addition, the timing of collection of 
the specimens is also important. We generally collect the specimens for the initial stage at the 
second visit to our clinic, prior to giving detailed tooth brushing instructions, which enable us 
to determine the natural bacterial profiles of each subject. The procedures for extraction of the 
bacterial DNA are as follows. The subgingival dental plaque specimens are collected in sterile 
saline,  which  are  centrifuged  at  15000  rpm  for  5  min  to  pellet  the  bacterial  cells.  Bacterial 
genomic  DNA  is  extracted  from  each  pellet  using  a  DNA  isolation  kit  (Puregene,  Gentra 
Systems,  Minneapolis,  MN,  USA).  As  for  the  saliva  samples,  expectorated  whole  saliva 
collected from each patient is mixed with Chelex 100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, 
USA), which is then incubated at 56°C for 30 min, followed by boiling at 100°C for 10 min. 
Each  sample  is  then  centrifuged  at  15000  rpm  for  20  min  and  the  supernatants  used  as 
templates for PCR assays.