Az élőlényekben, illetve azok egyetlen sejtjében
Yüklə 197,4 Kb. Pdf görüntüsü
|
11 EXTRA KÖVETELMÉNY Egy, az Mc1R (melanocortin 1 receptor) génben megfigyelhető SNP esetén azt figyelték meg, hogy több pheomelanin és kevesebb eumelanin termelődik, mint a normál változatban. Ezek az emberek vörös hajúak, nagyon fehér bőrűek, gyakran szeplősek. Az SNP-nek fenotípusban megjelenő hatása van. A kutatások azt is megállapították, hogy ezek az emberek egy altatóra, a midazolamra rezisztensek.
FEHÉRJECHIPEK A DNS-chip technológiával hasonló módon készülnek el a fehérje chipek, azzal a különbséggel, hogy a lecseppentett pontokban nem kölcsönható DNS molekulák, hanem fehérjékkel specifikus kölcsönhatásba lépő (általában) antitestek vannak kihorgonyozva. A biológiai mintából nem RNS-t vagy DNS-t vonunk ki, hanem fehérjét, amelyet szintén fluoreszcens festékkel jelölünk, majd a fehérje-chip felületén inkubáljuk a jelölt fehérjék elegyét. (A jelölési stratégiák között találunk direkt és indirekt módszereket is, előbbi esetben a már említett módon fluoreszcens festékkel jelöljük a fehérjét, míg utóbbi esetben a fehérjét biotinnal jelöljük, melyhez pl. fluoreszcens festékkel kapcsolt streptavidin kapcsolódik). A detektálás szintén a DNS-chipeknél már említett lézerszkenneres leolvasás, amelyet az intenzitásértékek meghatározása és kezelt és kezeletlen minták relatív fehérje mennyiségének meghatározása követ. Ezzel a módszerrel egy kísérletben több száz vagy akár ezer fehérje mennyisége határozható meg, így azonosíthatók olyan fehérjék, amelyeknek mennyisége egy gyógyszeres kezelés során megváltozott.
Alkalmas: gének transzkripciójának vizsgálatára, transzkripciós faktor kötő helyek, DNS metilációs helyek feltérképezésére, alternatív spicing analízisére. 25-60bp-os oligonukleotidokat, vagy PCR termékeket használnak próbaként. A próbákat szabályosan rendezik el, ennek 2-féle módja van: a próbák vagy átfedik egymást (azt jelenti, hogy úgy tervezik a próbákat, hogy az első 3’-vége és a következő 5’-vége átfedő bázisokat tartalmazzon), vagy kisebb-nagyobb hézag van közöttük. Step-nek nevezik a szomszédos próbák centrumainak távolságát. A vizsgált genomból származó cDNS-t, vagy cRNS-t fluoreszcensen jelölik, s hibridizálják az array felületére. Minél nagyobb az intenzitása, annál erősebb a transzkripció aktivitása.
a ciklusokban 3 lépés követi egymást: 1; denaturáció, 2; annelaing, 3; elongáció. A PCR
(Taq) – lemásolja az amplifikálandó szakaszt. (4) Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t. (5)Puffer – biztosítja az enzim számára megfelelő kémiai környezetet.
PCR alapelvein nyugszik. Alapvető funkciója, hogy meghatározott DNS-szakaszokat nagy hatékonysággal és nagyfokú specificitással amplifikáljon (szaporítson) fel. Működésének alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában Real-Time. A Real-Time PCR reakciók során a PCR-nál megismert reakció-összetevőkön túl szükség van fluoreszcens festék(ek)re, amelyek megfelelő fény hatására a ciklusok végén fényt emittálnak, s e fluoreszcencia intenzitása arányos az adott ciklus végére jelen lévő kópiák (DNS klónok) számával. A Real-Time PCR reakciók végén nincs szükség gél alapú kiértékelésre, az analízis szoftver alapú. 12 REAL-TIME vs END-POINT PCR: a hagyományos PCR-ok esetén csak a gélben való kiértékeléshez a beállított ciklusok lejárta után van lehetőség, tehát. end-point (végpont) analízisret végezhetünk csak. A Real-Time PCR során azonban lehetőségünk van a kezdeti ciklusok során képződő termékek mennyiségéről információt szerezni. REAL-TIME PCR – NEVEZÉKTAN: qPCR (kvantitatív) = Real-Time PCR: minden mintából származó fluoreszcens jelet numerikus értékké alakít át a reakció mindenegyes ciklusában. RT2 PCR: reverz transzkripción alapuló Real-Time PCR: olyan PCR reakció, melynek kiindulási templátja cDNS (mRNS-ről reverz transzkripcióval írják át) REAL-TIME PCR – A DETEKTÁLÁS LEHETŐSÉGEI: (1) nem specifikus módon ún. SYBR® Green festék használatával. (2) specifikus, ún. TaqMan® próbák használatával.
A SYBRGreen festék az etidium-bromidhoz hasonlóan interkalálódó molekula, amely a dupla szálú (ds) DNS kis árkába kötődik a reakcióelegyben. Bekötődve, adott monokróm fénnyel indukálva 530 nm-s hullámhosszú fényt emittál. Az ebből keletkező mérhető fluoreszcens jel nagysága a PCR folyamán szaporodó dsDNS mennyiségével arányosan növekszik. Ez a megoldás nem igényel extra próbákat (oligo, primer), ezért a relatíve olcsósága miatt népszerű.
meghatározható a minta DNS tartalma. Maga a próba egy 20-30 bp hosszúságú oligonukleotid, mely a felamplifikálni kívánt DNS szakasz egy, a közepén lévő régiójával komplementer. A próba a két végén módosított: 5’ vég: fluoreszcens festék molekulával jelölt → reporter (R). 3’ vég: a reporter fluoreszcenciáját kioltó, nem fluoreszcens quencher (NFQ) molekulát tartalmaz A próba intakt állapotában a kioltó molekula a reporterhez való fizikai közelségéből kifolyólag képes a reporter fluoreszcens emisszióját kioltani. Az energia átadás fluoreszcens rezonancia energia transzferrel (FRET) történik és a két molekula fizikai közelségén alapul. A TaqMan alapú PCR reakcióhoz, az amplifikáció működéséhez három oligonukleotid egyidejű bekötődése szükséges, mely a nagyfokú specificitást biztosítja. Az amplifikáció során a DNS polimeráz 5’-exonukleáz aktivitásának köszönhetően képes a próbát hasítani, miáltal a reporter távolabb kerül a kioltó molekulától, amely így már nem képes elnyelni a reporter által emittált fluoreszcenciát. A reakció előrehaladtával egy detektor folyamatosan érzékeli az exponenciálisan* növekvő fluoreszcenciát, ami arányos az adott minta kiindulási RNS (cDNS) tartalmával, a vizsgálni kívánt gén expressziójának mértékével. * ideális PCR reakciók esetén figyelhető meg az exponenciális növekedés: n-edik ciklus kópiaszáma 2
(Tm), mely definíciószerűen az a hőmérséklet, melyen az adott DNS fragmens 50%-a egyszálú. Az olvadáspontot leginkább befolyásoló tényezők: a fragment G+C tartalma, valamint hossza. A készülék a hőmérséklet fokonkénti emelése közben képes folyamatosan monitorozni a keletkező fluoreszcenciát. Amikor a kapillárisban a hőmérséklet eléri a vizsgált fragmens Tm értékét, a fluoreszcencia emisszió hirtelen csökkenni kezd, az alkalmazott fluoreszcens technikától függően, vagy azért, mert a (duplaszál-specifikus) SYBR Green I leválik az amplikonról, vagy azért, mert a hibridizációs próbák az amplikonról leolvadva már nincsenek többé megfelelő közelségben.
13 Mire használható az olvadáspont analízis? (1) mutáció detektálására, mivel a próba és a target közötti mismatch a Tm csökkenését okozza, (2) termékek megkülönböztetésére, mivel a rövidebb termékek (pl. primer-dimerek) Tm értéke alacsonyabb mint a specifikus fragmenté,(3) a termék azonosítására, a termékspecifikus Tm érték kimérésével.
PCR reakciók során keletkező termékek mennyiségi kiértékeléséhez szükség van a Ct (threshold cycle; küszöbfluoreszcencia) fogalom ismeretére. Minden egyes Real-Time PCR reakciónak van egy adott Ct értéke; mely az a ciklusszám, ahol az adott mintából származó fluoreszcens jel az ún. háttérfluoreszcencia (zaj) szintje fölé emelkedik. Zaj: a kezdeti ciklusokban nem a speifikus termékekből származó fluoreszcencia.
EXTRA KÖVETELMÉNY REAL-TIME PCR A GYAKORLATBAN – SNP DETEKTÁLÁS: SNP-k detektálásához a TaqMan alapú Real-Time PCR használható. Az allél specifikus PCR-nál megismert módon, az egyik primert itt is úgy tervezzük, hogy 3’-vége az SNP-re essen. A DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3’-vége az SNP-vel komplementer, s ebben az esetben a reporter festék fluoreszcenciája detektálható lesz.
EXTRA KÖVETELMÉNY REAL-TIME PCR A GYAKORLATBAN – EXPRESSZIÓ VIZSGÁLAT A chipekhez hasonlóan a Real_time PCR is a génexpressziós vizsgálatokban rendkívül hasznos. Ugyanúgy összehasonlíthatjuk vele a kezelt és kezeletlen, beteg és egészséges minták génexpersszióját. A limitáló tényező, hogy egyszerre jóval kevesebb mintáról kapunk információt, viszont a microarray-hez képest jóval érzékenyebb technika. Két minta Ct értéke közti különbségből (∆Ct) meghatározható a relatív kópiaszám (egyikben hányszor több kópia van, mint a másikban). FAKULTATÍV ANYAG RACE: Rapid Amplifiation of cDNA Ends (cDNS végek gyors felszaporítása): Módszer a cDNS-ek elejének és végének azonosítására. Az RNS-t reverz transzkripcióval (RT) cDNS-sé írjuk, majd PCR-rel felamplifikáljuk. A cDNS kópiákat megszekvenáljuk. Megkülönböztetünk 5’ és 3’ RACE-PCR módszert. 5’ RACE esetén az mRNS 5’-végéhez tapadó ún. génspecifikus primert használunk a reverz transzkripcióhoz. Ezután egy enzimmel (tDt: terminális dezoxinukleotid transzferáz) egy homopolimer „farkat” (azonos nukleotidokból áll) adunk a cDNS 3’ végére. A PCR során egy másik génspecifikus primerrel és a „farokkal” komplementer primert használunk a felamplifikáláshoz. 3’ RACE során a reverz transzkripciókor kihasználjuk az mRNS-ek 3’ végén lévő PolyA farkat (csupa T- ből álló OligodT primert használunk), ezért nincs szükség tDt-re. A PCR-t egy génspecifikus primer, s egy az OligodT-vel komplementer (csupa A) primerrel végezzük el. FAKULTATÍV ANYAG SAGE: Serial Analysis of Gene Expression (Génexpresszió sorozatvizsgálat): nagyszámú transzkriptum egymás melletti analízisére alkalmas. A módszer alapvetően két alapfeltevésen nyugszik: (1) egy rövid (kb 10-14 bázispár) nukleotidszekvencia-részlet elég információt tartalmaz ahhoz, hogy egy géntermék azonosítható legyen, (2) ezeknek a rövid szekvenciarészleteknek az egymásutáni láncolata lehetővé teszi sok géntermék egymásmelletti hatékony analízisét. A módszer során olyan, 9- 10 bázispár hosszúságú, úgynevezett SAGE-címkéket (tag-ek) kapunk, amelyek egy adott mRNS-populációt tükröznek. A technikának az az előnye, hogy segítségével a különböző kísérleti körülményekből származó mRNS-populációk között szignifikáns mennyiségi reláció 14 állítható fel. Érzékeny az alacsony kópiaszámú géntermék kimutatásában. A DNS-csipek előfutárának tekinthető, azonban időigényessége miatt ez a módszer mára jelentősen háttérbe szorult. A módszer lépései röviden a következők: (1) mRNS izolálás (2) mRNS kihorgonyzott OligodT-hez kapcsolása (PolyA-ja révén) (3) cDNS írás (RT) (4) Emésztés egy restrikciós endonukleázzal (RE); csak a kihorgonyzott részre lesz szükségünk (5) Egy RE hasítóhelyét tartalmazó adaptert ligálunk hozzá (olyan RE-t használunk, mely a felismerő helyéhez képest beljebb hasít)(6) Az előbb használt RE-vel megemésztjük (7) Az így kapott kis cimkéket (tag-eket) kettesével összeligáljuk (ditagek képződnek) (8) Ditagaket felszaporítjuk PCR-rel (9) Leemésztjük a végükről a hasítóhelyet tartalmaző adaptereket (10) Konkatamerekké ligáljuk össze és megszekvenáljuk.
különböző fajok genom struktúrája és funkciója közti hasonlóságokat vizsgálja. A genom szekvenálás eredményei lehetővé teszik, hogy az egyes élőlények genomjait géntartalmuk és a gének szerkezete szerint összehasonlítsák. Egyes fajokon belül is lehet összehasonlításokat tenni. A vizsgálatok eredményiből a gének szerepére és evolúciójukra lehet következtetni. Ha egy bizonyos genom szekvencia, vagy mintázat egy adott, közös leszármazási vonalú (monofiletikus) rendszertani kategória tagjai között gyakori, akkor konzervatív szekvenciáról beszélünk. Egy-egy ilyen szekvencia, azaz motívum evolúciós konzerváltsága arra utal(hat), hogy szelekciós előnyhöz juttatja az ezzel rendelkező élőlényeket. A konzervatív szekvenciák kifejeződhetnek, mint fehérjék, de lehet, hogy szabályozó szerepet töltenek be. Találtak olyan konzervált DNS-szakaszokat is, melyekről RNS leíródik, de fehérje nem képződik. Ezek szerepe még nem tisztázott (valószínűleg szabályozó RNS-ekről van szó). Hasonló szekvenciák azonosítása (géneket is beleértve) távoli rokon élőlényekben (nem monofiletikusak), ahhoz a feltevéshez vezet, hogy ezekre az egyikük horizontális géntranszferrel tett szert. Ez a jelenség baktériumok körében gyakori, de magasabbrendűeknél is előfordul. Eukarióta genomokban is jelen lehetnek prokarióta eredetű gének. Ezek mitokondriális (vagy növények esetében színtestek) felépítésében résztvevő fehérjéket kódolnak, az endoszimbionta elméletet támasztva alá. Számos genomikai vizsgálatot végeztek, melyek az emberi agy kialakulásának megértését tűzték ki célul.
EXTRA KÖVETELMÉNY MYH16 (miozin nehézlánc kódoló gén): egy philadelphiai klinikán azt találták, hogy bármely populációból származó minden emberben az MYH16 géneknek két DNS-bázisa hiányzik, ha összehasonlítjuk bármely más főemlős hasonló génjeivel, tehát redukció történt. A főemlősökben található változat a hosszú, eredeti verzió előfeltétele volt annak, hogy erős rágóizom fejlődjön ki. Ez a nagy rágóizom, amely szükséges az egész napos táplálkozásnál (ez a nagyizom a csimpánznál is megtalálható), a halántéki csonton található nagy csontkiemelkedéshez kapcsolódik. Anatómiai tanulmányok arra utalnak, hogy ez az extra csontmegnagyobbodás valamilyen módon gátló kapcsolatban van az agykoponya kiterjedésével és az agykoponya csontjai között található növekedési gócokkal: s ezek növekedésgátlásán keresztül gátolja az agykoponya, s az agy fejlődését is. A mutáció során kialakuló, emberi gén egy rövidebb gén, mely kevesebb rágóizom-fehérjét termel, így csökken a rágóizom nagysága is. Emiatt nem szükséges extra csontkiemelkedés a koponyán, tehát felszabadítja a koponyát a növekedését gátoló tényező alól. Tehát növekedhet a koponya, így az agyunk is. Kutatók a vizsgálatok alapján azt gondolják, hogy ez a mutáció, amelyet a „gondolat szobájának” neveztek el, kb. 2,4 millió évvel ezelőtt jött létre, éppen Homo nemzetség fejlődésének egy olyan szakaszában, amikor ezzel párhuzamosan felgyorsult az agy fejlődése is.
15 EXTRA KÖVETELMÉNY FOXP2 (forkhead box protein P2): a „beszéd génje”. Az a protein, amelyet kódol, szinte azonos az egérben, csimpánzban és az emberben. A 715 aminosavból két aminosav különbözik a csimpánz és az ember között. (Az egér és a csimpánz között csak néma mutációk vannak). A kutatók szerint a FOXP2 génnek ez a humánspecifikus mutációja kb. 50-100 000 évvel ezelőtt jött létre. Ez a mutáció teszi lehetővé azokat a finom mozgásokat, amelyek szükségesek ahhoz, hogy motorikusan létrejöjjön a beszéd. Ilyen módon a FOXP2 gén kis mutációja jelentős mértékben hozzájárult a beszéd és a nyelv kifejlődéséhez.
EXTRA KÖVETELMÉNY HAR (Human Acceleraled Region): nagyon felgyorsult evolúciós változáson ment át az emberelődökben és az emberekben, s különösen aktív az agyfejlődés kritikus szakaszában. Összehasonlították a csimpánzok és emberek genomjait, kiderítették, hogy kb. 48 olyan terület található a humán emberi genomban, amelyek különösen gyorsabban fejlődtek, mint a csimpánz vagy más állatok ugyanazon 48 régiója. Az egyik régió ezek közül a HAR. Az elemzések során kimutatták azt is, hogy a HAR1 lényegében ugyanaz minden emlősben, kivéve az embereket. Ez a hasonlóság azt jelenti, hogy ez a DNS-szekvencia tulajdonképpen változatlan maradt százmillió éveken keresztül az evolúció során, ami egyben azt is jelzi, hogy egy biológiailag rendkívül fontos funkciót lát el. Abban az időben azonban, amikor az emberi vonal szétvált a csimpánzzal közös elődtől, kb. öt-hétmillió évvel ezelőtt, a HAR1 elkezdett változni, sokkal gyorsabban, mint azelőtt. Egyáltalán, míg azelőtt nem volt lényegi változás, most rendkívüli módon változott: 18 különbséget találtak a csimpánz és a humán HAR1 DNS-e között, ami fantasztikusan gyors és nagy változás, különösképpen figyelembe véve azt, hogy néhány millió év alatt játszódott le. Különösen fontos e tekintetben az, hogy a neokortexnek az első része a prefrontális, vagyis előhomloki lebeny, kortex, rendkívüli módon, hatalmasra fejlődött a hominid evolúcióban, az ember fejlődése során.
mint 50 eukarióta genom nukleotid sorrendjét olvasták le. Szinte minden „completly sequenced” genom tartalmaz hiányokat, nem szekvenált szakaszokat. Ezek főként heterokromatin szakaszok. Ezért a genomok mérete, DNS tartalomban és génszámban egyaránt becslésen alapszik. Az eukarióta genomok DNS tartalma nagyobb, mint a prokariótáké. Az egyes eukarióták komplexitása és genomjuk DNS tartalma vagy génjeik száma között nincs szoros összefüggés. Például a lúdfű genomja nagyobb a bonyolultabb
több génje van, mint a muslicának. Az ember vagy az egér és a fugu halnak körülbelül ugyanannyi génje van, de a fugu genom DNS tartalma csak kb. tizede az egér vagy ember genomjának. Humán genom csak szemléltetés
Eukarióta genomok Sejtmagi, mitokondriális és kloroplasztisz genom. Ismétlődő genetikai szegmensek, transzpozonok, stb. Az emberi genom struktúrája gyakorlatilag 100-osan ismert (egy prototípus), azonban a gének funkciójáról jóval kevesebb az ismeret. A jövő a genomika és a bioinformatika alapján új utat jelöl ki az orvosbiológia fejlődésében, a megelőzésben, diagnosztikában és a gyógyításban, gyógyszer-, védőoltás- fejlesztésben egyaránt. A bioinformatika és a genomika révén jelentősen nő az esély az életminőség javítására, az átlagéletkor emelésére. Yüklə 197,4 Kb. Dostları ilə paylaş:
|