Az élőlényekben, illetve azok egyetlen sejtjében
Yüklə 197,4 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- SZEMÉLYRE SZABOTT GYÓGYMÓDOK KIALAKÍTÁSA
5 EXTRA KÖVETELMÉNY Oxford Nanopore Technologies: Foszfolipid kettősréteg két oldalán töltésegyenlőtlenség van, a DNS molekulák a negatív helyek felől a pozitív felé igyekeznek. Az egyetlen lehetséges út számukra az α-hemolizin által alkotott 1nm-es átmérőjű nanopórusok tömege, ezen haladnak át a DNS láncok. A nanopórus ciklodextrinnel bélelt, ami szükséges a detekcióhoz. A nanopórushoz exonukleáz enzim van rögzítve, mely a pórushoz közeledő DNS-ről egyesével levagdossa a nukleotid bázisokat, melyek így egyesével haladnak át a nanopóruson, a rájuk jellemző mértékben változtatják meg az áramerősséget, amelyet a készülékkel detektálni tudunk.
hasítják, egyszálúsítják, majd az ssDNS-ekhez 6 bp-os, ismert szekvenciájú oligókat hibridizálnak (párhuzamosan futó reakciókban különböző bázissorrendűeket, de egy adott „csőben” egy adott típusút). Ez az oligó a 100 kb-s DNS számos régiójával komplementer, s ezen régiókhoz oda is hibridizál. A DNS-t egy vékony membrán pórusain „préselik” át, s közben áramerősséget mérnek az idő függvényében. Amikor a 6-mer-es oligóval hibridizált DNS rész érkezik a nanopórushoz, az áramerősség megváltozik. Ezt a készülék megjegyzi, s beazonosítja, h a genom ezen régiója az ismert szekvenciájó oligó komplementere; az áramerősség monitorozásából lehet tehát a primer pozíciójára, s ebből a DNS régió szekvenciájára következtetni. Az ugyanolyan próbákkel hibridizált hosszú DNS szakaszokat az átfedő próbák alapján állítják sorba, s így megkapják az adott próba genomi térképét. Rengetek típusú oligó párhuzamos használatával megkapható az összes próba teljes géntérképe. A próbák elhelyezése közti hézagokat az ún „moving window Sequencing By
Miért jó a DNS szekvenciák ismerete? A DNS szekvencia ismeretében lehetővé válik: genetikai hátterű betegségekre való hajlam kimutatása fertőzések diagnosztikája (a kórokozók azonosítása) rokonsági fok meghatározása (apasági vizsgálatok) személyazonosítás (bűnüldözés) génváltozatok összehasonlítása törzsfák készítése különböző biológiai folyamatok kutatása betegségek genetikai hátterének elemzése terápiás lehetőségek kidolgozása
Chromosome walking (kromoszóma séta) Hosszú (250 kb-ig) random, DNS fragmentek könyvtára (általában BAC vektorban). A fizikai térkép (az a térkép, mely megmutatja a genom egy részletét, vagy a kromoszómát alkotó anyag elrendezését) megszerkesztésére alkalmas technika. A genomkönyvtárból kiválogatják az egymással átfedő klónokat, és így meghatározzák az egymás után elhelyezkedő gének sorrendjét. Lényegében az ismert (marker) gént tartalmazó kiindulási klónt fragmentálják, és minden fragmentet szubklónoznak, hogy génpróbaként használják a szomszédos és az egymást átfedő szegmenseket tartalmazó egyéb klónok azonosítására. Másfelől ezeket a szomszédos szegmenseket fragmentálják és szubklónozzák, és próbaként használják a további árfedésekre, és így tovább. A klónozott szegmentumokat a kromoszómán is található megfelelő sorrendbe helyezik.
6 EXTRA KÖVETELMÉNY: A módszer finomításakor, melyet kromoszómaugrásnak neveznek, csak a szegmensek végeit azonosítják, így a vizsgálatot végző a középen lévő szakaszokat „átugorhatja”. Így felgyorsul a folyamat, és így figyelmen kívül hagyhatják a ismétlődő DNS szakaszokat, amelyek a kromoszóma séta alkalmazásával nem kezelhetők.
be, hogy hogyan lehet megállapítani PCR-ral, hogy számos klón közül melyik fed át egy adott fragmenssel. Az 1-es sorszámú fragment felamplifikálására tervezett primer párt felhasználják az összes többi (2-26) fragment felsokszorozására is, majd az eredményt gélben megfuttatják. Amint látható , a 25 klón közül egyedül a 14-es sorszámú eredményezett PCR terméket (DNS-t), tehát ez a klón és az 1-es számú átfednek egymással.
A FUNKCIONÁLIS GENOMIKA ESZKÖZTÁRA (1) Real‐Time PCR (2) Microarray technológia (DNS és fehérje chipek) (3) Whole Genome Tiling (4) RACE (5) SAGE
már egy microarray-vel kimutatott komplett eukarióta genomról az élesztőgomba genomról (Saccromyces cerevisiae) számoltak be amerikai szerzők. 2001 óta baktériumok, élesztő, szőlőmuslica, fonalféreg és növények mellett az emberi genom és az egér teljes genomiális géntérképe rendelkezésre áll, a világháló adatbázisaiból lehívható és elemezhető. 2005 –ben vált ismertté a kutya teljes genomja. Az évszázadokon át tartó, beltenyésztésekkel tarkított kutyatenyésztés révén olyan fajták alakultak ki, melyek bizonyos fajta betegséggel szemben rendkívül fogékonyak, vagy éppen ellenkezőleg, rezisztensek. E kutyafajták és a kapcsolódó betegségek vizsgálata humán szempontból is rendkívül jelentős, (részben) ezért vált a kutya a kardiológiai-, rák-, cukorbetegség-, magatartásbeli rendellenességek- és számos más, genetikai eredetű humán betegség legfontosabb modellállatává. már létezik a kutya- microarray. 2010 – Panda és az első békafaj genom szekvenciája ismert, utóbbi kiváló modell az emberi szervezet vizsgálata szempontjából, a microarray bevezetése már csak rövid idő kérdése.
A DNS CHIP (MICROARRAY) TECHNOLÓGIA: A huszadik század végéig a gének funkciójának és szabályozásának tanulmányozása egyedi vizsgálatokon alapult. Köszönhetően annak, hogy egyre több organizmus genomjának szekvenciája vált és válik ismertté, új technikák alakultak ki, melyekkel számos gén expressziójának egyidejű tanulmányozása válik lehetővé. A technikák közül az egyik automatizálható módszer a chip technológia, melynek bevezetése (1996) forradalmasította a molekuláris biológiát, a funkcionális genomikát és napjainkban a klinikai diagnosztikai módszereket is. A chipek két típusa, DNS-, ill. fehérje chipek közti alapvető különbség a vizsgálat tárgya: a DNS-chipek a (1) génexpresszió megváltozásának vizsgálatát, (2) splice-variánsok, valamint (3) szabályozó RNS-ek kimutatását teszik lehetővé, míg a fehérje chip a proteom (1) kifejeződését, (2) módosulásait, (3) kölcsönhatásait megcélzó vizsgálatok eszköze. A transzkriptom vizsgálata mellett a DNS-chipekkel lehetőségünk van (1) mutációk, (2) SNP-k ,
mintázat felderítésére (Strukturális genomika).
Yüklə 197,4 Kb. Dostları ilə paylaş:
|