Az élőlényekben, illetve azok egyetlen sejtjében

 

3 

A

Z ÚJGENERÁCIÓS TECHNIKÁK KÖZÜL EGY TETSZŐLEGESEN KIVÁLASZTOTTAT KELL MEGÉRTENI ÉS 

MEGTANULNI

,

 EXTRA KÖVETELMÉNYKÉNT 

(DIA

 

7,

 

9,

 

10,

 

11,

 

13,

 

14). 

 

 

EXTRA  KÖVETELMÉNY  Hibridizáláson  alapuló  módszer  (Sequencing  by 

hybridization, SBH): DNS mikroarray-en alapuló, nem enzimatikus módszer. Teljes genomok 

megszekvenálására  alkalmas.  Ennél  a  megközelítésnél  a  fluoreszcensen  jelölt  templát  DNS 

fragmenseit  ismert  szekvenciákat  tartalmazó  mikroarray  (chip,  vagy  membrán)  felszínéhez 

kötik (így tehát annak minden pontján – spot – ismert és egymástól különböző szekvenciájú 

oligók  vannak).  Egy  adott  spot-ból  származó  fluoreszcens  jel  azt  jelenti,  hogy  oda  egy 

komplementer szekvencia hibridizált, melynek bázissorenje tehát az array adott pontjárhoz 

kötött  oligó  komplementere.  A  chip  kb.  10  cm2-es,  és  60  millió  egyszálú  DNS  van  hozzá 

kötve.  Egy-egy  kis  „négyzet”  400.000  próbát  tartalmaz.  A  Perlegen  nevű  amerikai  cég 

használja főemlősök kromoszómáinak és a humán genom SNP-inek vizsgálatához. A genom 

szkennerük  hatalmas  „gén  chipek”-ből  áll,  mely  parallel  képes  kiválogatni  egyedi  DNS 

szegmensek millióit, s így teszi lehetővé az SNP-k millióinak detektálását. 

 

 

DNS szintézisen alapuló szekvenálási módszerek  

Közös jellemzőik  



 

DNS polimeráz (enzimatikus reakciók)  



 

Fénydetekció  



 

Parallel, multiplex módszerek  



 

Típusaik  

o

 

Piroszekvenálás  

o

 

tSMS: valódi egymolekulás szekvenálás  

o

 

SMRT: egymolekulás real-time technológia  

 

 

EXTRA  KÖVETELMÉNY  Piroszekvenálás:  A  piroszekvenálás  egy  enzim-

kaszkád,  mely  real-time  (valós  idejű)  detekciót  tesz  lehetővé.  A  target  DNS-t  feldarabolják, 

gyantához,  vagy  valamilyen  hordozóhoz  rögzítik,  hozzáadják  a  DNS  polimerázt,  mely 

facilitálja  az  amplifikációt  (DNS  szintézist):  a  hordozó  felület  egy  pikoliter  nagyságú 

kamrájában  egyetlen  DNS  fragment  millió  kópiában  lesz  jelen.  A  minta  ATP-szulfuriláz  és 

luciferáz enzimeket valamint adeno-foszfoszulfátot (APS) és luciferint is tartalmaz. A reakció 

első  lépéseként  egy  típusú  dNTP-t  adnak  a  rendszerhez,  s  ha  a  templáton  az  adott 

nukelotiddal  komplementer  bázis  következik,  akkor  az beépül  a  készülő láncba.  A dNTP-ről 

leszakad  egy  pirofoszfát  (PPi),  melyet  a  szulfuriláz  megköt  és  az  APS-ből  ATP-t  állít  elő, 

melyből  a  luciferáz  a  luciferin  segítségével  fényfelvillanást  hoz  létre.  A  felvillanást  kamera 

érzékeli, melyből következtetnek a soron következő bázis milyenségére (A, T, G, vagy C). (Az 

ATP-nek  egy  olyan  módosult  változatát  használják  a  DNS  szintézishez,  melyet  a  DNS 

polimeráz  fel  tud  használni,  az  szulfuriláz  viszont  nem,  így  a  keletkező  ATP  biztosan  a 

pirofoszfátból származik, s nem a hozzáadott ATP-ről van szó). Ha a templáton egymásután 

ugyanazon bázisok ismétlődnek (pl. GGGG), akkor a dCTP-k hozzáadásakor négy fog beépülni 

a  szintetizálódó  DNS-be,  ennek  köszönhetően  a  luciferáz  négy  luciferint  tud  felhasználni,  s 

emiatt a fényfelvillanás a kamera által is érzékelhetően, négyszer erősebb lesz. A dNTP-ket 

addig adják a rendszerhez, míg a teljes templát végére nem érnek. A be nem épült dNTP-ket 

és a fölösleges ATP-t az apiráz enzim bontja le még a következő ciklus előtt.

 

 

 

---

 

4 

 

EXTRA KÖVETELMÉNY Helicos tSMS (True Single Molecule Sequencing) a 

szekvenálni  kívánt  DNS-t  100-200  bp-os  darabokra  vágják  (restrikciós  endonukleázokkal), 

majd a kettős hélixeket széttekerik: 94°C-ra melegítik, s így denaturálják. Egyetlen kis kamra 

felületére  kötik  a  100-200  bp-ra  darabolt  DNS  molekulák  milliárdjait  olyan  módon,  hogy  a 

kamra felszínéhez oligoT-k vannak kötve rendkívül nagy denzitással: egy négyzetcentiméter 

felületen  100  millió.  A  feldarabolt  DNS  szálakhoz  fluoreszcensen  jelölt  poly-A-kat 

„ragasztanak”  (adapter),  majd  ezek  hibridizálnak  az  oligoT-kel,  így  a  DNS  molekulák  a 

felszínhez kötődnek. Ezek a DNS szálak, mint templátok fognak viselkedni a szintézis során, 

primerként  pedig  az  oligoT  fog  funkcionálni.  A  „DNS-ekkel  hibridizált  kamrát”  behelyezik  a 

Heliscope  készülékbe,  ahol  gerjesztő  (lézer)  fény  hatására  világítani  fognak  azok  a  pontok, 

ahová  DNS  kapcsolódott.  (A  lézerfény  feltérképezi,  hogy  hol  vannak  a  szintetizálásra  váró 

DNS szálak). Ezután lemossák a fluorszcens molekulát a felületről, s megkezdik a szintézist, s 

egyben  a  szekvenálást.  E  folyamatok  első  lépéseként  DNS  polimeráz  enzimet  és 

fluoreszcensen  jelölt  dNTP-t  adnak  a  rendszerhez.  Nagyon  fontos  tudni,  hogy  ennél  az 

eljárásnál  egy  lépésben  csak  egy  fajta  dNTP-t  (pl.  először  csak  dATP-t)  használhatunk.  A 

hozzáadott  dATP-k  csak  oda  épülnek  be,  ahol  a  lánc  poly-A  utáni  első  bázisa  T  (timin).  A 

gerjesztő  fény  hatására  ezek  a  helyek,  azaz  ezek  a  DNS  szálak  világítani  fognak.  Következő 

lépésként  lemossák  a  felesleges  (azaz  be  nem  épült)  dATP-ket,  s  új  reakciót  indítanak,  de 

ebben a reakcióban egy másik fluoreszcensen jelölt dNTP (dCTP-t, vagy dGTP-t, vagy dTTP) 

használnak. Ezek is csak a velük komplementer bázisok esetén épülnek be a láncba. Minden 

lépés végén csak azok a DNS szálak világítanak, melyek soron következő bázisa a reakcióhoz 

adott dNTP komplemetere (azaz dATP esetén T, dCTP esetén G, dGTP esetén C, dTTP esetén 

pedig A), s a készülék minden lépés után fotót készít a világító régiókról. E módszer (Helicose 

Ltd.)  jellemzője,  hogy  minden  DNS  szál  egyedi,  egymástól  függetlenül  szekvenálódik,  s 

használatával naponta milliárd bázis nagyságrendben lehet szekvenálni.  

 

 

EXTRA  KÖVETELMÉNY  SMRT  (Single  Molecule  Real-Time,  Egymolekulás 

Real-Time)  technológia:  ezzel  a  megközelítéssel  az  ötletgazda  Pacific  Biosciences  szerint 

2013-ra  humán  genom  megszekvenálása  100$-ból  15  perc  alatt  megvalósítható  lesz.  A 

folyamat  ún  SMRT  kamrákban  zajlik,  a  DNS  szintézist  fluoreszcensen  jelölt  nukleotidokkal 

(mind  különböző  színű)  oldják  meg.  Azonban  festéket  a  foszfátcsoportra  teszik,  nem  a 

bázisra, s így, mikor az adott bázis beépül a szinetizálódó szálba, a DNS polimeráz a festéket 

levágja  róla,  melynek  felvillanását  ZMW  (Zero  Mode  Waveguide)  nanofotonikus  vizualizáló 

kamra érzékeli. Ez a kamera 20 zeptoliter (10-21 liter) minta detektálására alkalmas. Egymás 

mellett számos SMRT kamrákban zajlik a folyamat, tehát multiplex módszer, paralell minták 

ezrei szekvenálhatók meg a DNS polimeráz működési sebességének megfelelő idő alatt.

 

5  

 

 

Nanopórusos  szekvenálás:  ultragyors  (többszáz  kb  megszekvenálása 

néhány  perc  alatt)  és  olcsó  szekvenálási  módszer  (a  teljes  genom  megszekvenálásának 

költségeit  kb  4  nagyságrenddel  csökkenti).  A  különböző  cégek  más-más  módszereket 

dolgoztak  ki  (Oxford  Nanopore  Technologies;  NabSys);  közös  jellemzőjük,  h  nem 

enzimatikus reakciókról van szó, s nem fényt, hanem áramerősséget detektálnak.

  

 

---