1
G
G
E
E
N
N
O
O
M
M
I
I
K
K
A
A
Fogalmak A
genom az élőlényekben, illetve azok egyetlen sejtjében
található öröklési anyag (DNS) teljes állománya. A genetika a tulajdonságok öröklésével,
egyes gének szerkezetével és működésével foglalkozik. A genomika a genom vizsgálatával
foglalkozó tudomány. 1995-ben „született”, amikor meghatározták az első sejtes élőlény (a
Haemophilus influenzae baktérium) teljes DNS-szerkezetét (nukleotidsorrendjét). A
genomika tárgya az élőlény génjeinek, illetve DNS-ének összessége. A genomika tehát
vizsgálja az egyes genomok szerkezetét, a gének eloszlását, számát, méretét, a génnek nem
tekinthető DNS-szakaszok (intergénikus, gének közti régiók) szerkezetét, elhelyezkedését,
biológiai szerepét, összehasonlítja a különböző genomokat egymással. A genomika
megismeri a DNS-szerkezetet és annak ismeretében keresi meg az egyes DNS-szakaszok
funkcióit.
A genomika főbb területei (1) Strukturális (szerkezeti) genomika: nem foglalkozik a
funkcióval, csupán leltárba, veszi a DNS elemeit, a DNS-t alkotó bázisok sorrendjét határozza
meg. A genomikai módszereket elsősorban DNS szerkezetének a vizsgálatára használják,
nem pedig a DNS megváltoztatására. A strukturális genomika létrejöttének alapvető feltétele
a DNS szekvenálás (bázis sorrend megállapítása) módszerének megalkotása volt. A
tudományterület létrejöttét a DNS szekvenálás alapozta meg (Frederick Sanger, az 1970-es
évek eleje), azonban a napjainkban tapasztalható rohamos fejlődés nem az általa kidolgozott
dideoxi-nukleotid módszer, hanem az új generációs, ún. high-throughput (nagy-volumenű)
szekvenálási technikáknak köszönhető.
(2) Funkcionális genomika: vizsgálódási területei a transzkriptom (és a proteom) működése,
változása. A genomikai módszereket elsősorban DNS működésének a vizsgálatára használják.
Funkción elsősorban mRNS-ek vagy fehérjék egyidejű expressziójának a vizsgálatát értik,
abban az értelemben, hogy egy kezelt (vagy beteg) szövetben megváltozik-e, s ha igen,
mennyire az egyes gének kifejeződése.
(2a) Transzkriptomika: a genomról képződő transzkriptumok (RNS-ek) összességével
foglalkozik.
(2b) Proteomika: a fehérjék összességével foglalkozik.
A genomika további területei:
Integratív genomika: ötvözi a genomikai, sejtbiológiai tudást az informatikával, s azt
vizsgálja, hogyan állnak össze a részek egy működő egésszé.
Komparatív (összehasonlító) genomika: az a tudományterület, mely a különböző fajok
genom struktúrája és funkciója közti hasonlóságokat vizsgálja.
Metabolomika: az anyagcserében résztvevő enzimek összességével foglalkozik.
In silico genomika: számítógépes predikciókat (jóslatokat, hipotéziseket) ad, egy-egy gén
in
vivo működéséről.
Farmakogenomika: gyógyszerek és genomok interakcióinak vizsgálata.
Pszichogenomika: a farmakegenomika ága, hangulat-javító (antidepresszáns, stb.) szerek
genomra, génekre gyakorolt hatását vizsgálja.
2
A Sanger-módszer (Lásd „A molekuláris biológia technológiai arzenálja
II.”, DIA 6-9): in vitro DNS szintézis, amely során izotóppal jelölik a keletkező új szálat. E
módszer eredeti verziója szerint előállítják a templát DNS egyes szálát (single-stranded DNA;
ssDNS), majd radioaktívan (újabban fluoreszcensen) jelölt primert hibridizálnak hozzá.
Ezután négyfelé osztják az elegyet és kiegészítő szálat szintetizálnak az eredeti lánchoz dNTP-
k (dezoxiribonukleotid-trifoszfát) jelenlétében (DNS polimeráz enzim segítségével), minden
esetben úgy, hogy a reakcióelegyekben egy-egy dideoxi-nukleotid (ddNTP) is jelen van (a
módszer ennek köszönheti másik közismert nevét: dideoxinukleotid-módszer). A DNS
polimeráz hatására megindul a kiegészítő DNS lánc szintézise, de bizonyos esetekben, amikor
véletlenszerűen egy dideoxi analóg épül be a „normál” nukleotid helyett, akkor a szintézis
nem tud folytatódni, hanem megáll (innen származik a technika 3. neve: stop-nukleotid
módszer, vagy lácterminációs módszer). A ddNTP cukor-foszfát láncáról hiányzik egy hidroxil
csoport (a szén 3’ helyén, s helyette egy H van), tehát a következő dNTP nem tud hova kötni,
nem tud foszfodiészter kötést kialakítani. Mivel a ddNTP-k kapcsolódása a DNS szálhoz
véletlenszerűen történik, az egyes reakciók véletlenszerűen állnak le. A kapott DNS
fragmenteket (poliakrilamid) géleken megfuttatjuk, majd autoradiográfiával (vagy a
fluoreszcens festéket detektálva, megfelelő gerjesztőfénnyel) meghatározzuk a helyzetüket.
Végül alulról felfelé olvasva megkapjuk a vizsgált oligonukleotid szekvenciájának
komplementerét. A DNS-szekvenálás az 1980-as évek végéig manuálisan történt. Ezzel a
módszerrel, egyetlen ilyen készüléket alkalmazva, a humán genom megszekvenálása 1000
évebe telne!!! (Hogy a jelenlegi tudással rendelkezzünk az emberi genomot illetően, a
szekvenálást már a Honfoglaló magyaroknak el kellett volna kezdenie )
Automatizált festék-terminációs módszer: az eljárás során a négyféle
ddNTP-hez négyféle fluoreszcens anyagot kapcsolnak, és négyféle reakcióelegyben végzik el
a DNS polimeráz által vezérelt reakciót (DNS szintézist). A reakcióelegyet ezután egyetlen
mintakamrába helyezik és elvégzik az elektroforézist. Megfelelő gerjesztő fény
alkalmazásakor a fluoreszcencia színe fogja jelenteni az adott nukleotidot, mely megfelel a
beépült ddNTP-nek. Ezeket automata méri, így napi 10 000 bázisnyi szekvencia is
meghatározható. Egyetlen ilyen automata készülék alkalmazása esetén a teljes humán
genom szekvenciájának meghatározása 1000 évet venne igénybe. Robotok alkalmazása
gyorsítja a szekvenálást.
Nagy-volumenű, újgenerációs szekvenálási módszerek
MULTIPLEX DNS SZEKVENÁLÁS
Hibridizáció alapú
o
SBH
DNS szintézisen alapuló
o
Piroszekvenálás
o
tSMS
o
SMRT
Nanopórusos technikák