11
EXTRA KÖVETELMÉNY Egy, az Mc1R (melanocortin 1 receptor) génben
megfigyelhető SNP esetén azt figyelték meg, hogy több pheomelanin és kevesebb eumelanin
termelődik, mint a normál változatban. Ezek az emberek vörös hajúak, nagyon fehér bőrűek,
gyakran szeplősek. Az SNP-nek fenotípusban megjelenő hatása van. A kutatások azt is
megállapították, hogy ezek az emberek egy altatóra, a midazolamra rezisztensek.
FEHÉRJECHIPEK
A DNS-chip technológiával hasonló módon
készülnek el a fehérje chipek, azzal a különbséggel, hogy a lecseppentett pontokban nem
kölcsönható DNS molekulák, hanem fehérjékkel specifikus kölcsönhatásba lépő (általában)
antitestek vannak kihorgonyozva. A biológiai mintából nem RNS-t vagy DNS-t vonunk ki,
hanem fehérjét, amelyet szintén fluoreszcens festékkel jelölünk, majd a fehérje-chip
felületén inkubáljuk a jelölt fehérjék elegyét. (A jelölési stratégiák között találunk direkt és
indirekt módszereket is, előbbi esetben a már említett módon fluoreszcens festékkel jelöljük
a fehérjét, míg utóbbi esetben a fehérjét biotinnal jelöljük, melyhez pl. fluoreszcens festékkel
kapcsolt streptavidin kapcsolódik). A detektálás szintén a DNS-chipeknél már említett
lézerszkenneres leolvasás, amelyet az intenzitásértékek meghatározása és kezelt és
kezeletlen minták relatív fehérje mennyiségének meghatározása követ. Ezzel a módszerrel
egy kísérletben több száz vagy akár ezer fehérje mennyisége határozható meg, így
azonosíthatók olyan fehérjék, amelyeknek mennyisége egy gyógyszeres kezelés során
megváltozott.
EXTRA KÖVETELMÉNY WHOLE GENOME TILING – TELJES-
GENOM CSEREPEZÉS: A teljes genom vizsgálatához használt újabb típusú microarray.
Alkalmas: gének transzkripciójának vizsgálatára, transzkripciós faktor kötő helyek, DNS
metilációs
helyek
feltérképezésére,
alternatív
spicing
analízisére.
25-60bp-os
oligonukleotidokat, vagy PCR termékeket használnak próbaként. A próbákat szabályosan
rendezik el, ennek 2-féle módja van: a próbák vagy átfedik egymást (azt jelenti, hogy úgy
tervezik a próbákat, hogy az első 3’-vége és a következő 5’-vége átfedő bázisokat
tartalmazzon), vagy kisebb-nagyobb hézag van közöttük. Step-nek nevezik a szomszédos
próbák centrumainak távolságát. A vizsgált genomból származó cDNS-t, vagy cRNS-t
fluoreszcensen jelölik, s hibridizálják az array felületére. Minél nagyobb az intenzitása, annál
erősebb a transzkripció aktivitása.
PCR – ISMÉTLÉS: egy-egy PCR reakció ciklusokból áll (kb 30-50);
a ciklusokban 3 lépés követi egymást: 1; denaturáció, 2; annelaing, 3; elongáció. A PCR
reakcióhoz szükséges: (1) DNS-templát – tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját.
(2) 2 primer – meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét. (3)DNS-polimeráz
(Taq) – lemásolja az amplifikálandó szakaszt. (4) Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz
felépíti az új DNS-t. (5)Puffer – biztosítja az enzim számára megfelelő kémiai környezetet.
REAL-TIME PCR – ALAPOK: A Real-Time PCR (valós idejű PCR) technika a
PCR alapelvein nyugszik. Alapvető funkciója, hogy meghatározott DNS-szakaszokat nagy
hatékonysággal és nagyfokú specificitással amplifikáljon (szaporítson) fel. Működésének
alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában
Real-Time. A
Real-Time PCR reakciók során a PCR-nál megismert reakció-összetevőkön túl szükség van
fluoreszcens festék(ek)re, amelyek megfelelő fény hatására a ciklusok végén fényt
emittálnak, s e fluoreszcencia intenzitása arányos az adott ciklus végére jelen lévő kópiák
(DNS klónok) számával. A Real-Time PCR reakciók végén nincs szükség gél alapú
kiértékelésre, az analízis szoftver alapú.
12
REAL-TIME vs END-POINT PCR: a hagyományos PCR-ok esetén csak a
gélben való kiértékeléshez a beállított ciklusok lejárta után van lehetőség, tehát. end-point
(végpont) analízisret végezhetünk csak. A Real-Time PCR során azonban lehetőségünk van a
kezdeti ciklusok során képződő termékek mennyiségéről információt szerezni.
REAL-TIME PCR – NEVEZÉKTAN: qPCR (kvantitatív) = Real-Time PCR:
minden mintából származó fluoreszcens jelet numerikus értékké alakít át a reakció
mindenegyes ciklusában. RT2 PCR: reverz transzkripción alapuló Real-Time PCR: olyan PCR
reakció, melynek kiindulási templátja cDNS (mRNS-ről reverz transzkripcióval írják át)
REAL-TIME PCR – A DETEKTÁLÁS LEHETŐSÉGEI: (1) nem specifikus
módon ún. SYBR® Green festék használatával. (2) specifikus, ún. TaqMan® próbák
használatával.
A SYBRGreen festék az etidium-bromidhoz hasonlóan interkalálódó
molekula, amely a dupla szálú (ds) DNS kis árkába kötődik a reakcióelegyben. Bekötődve,
adott monokróm fénnyel indukálva 530 nm-s hullámhosszú fényt emittál. Az ebből keletkező
mérhető fluoreszcens jel nagysága a PCR folyamán szaporodó dsDNS mennyiségével
arányosan növekszik. Ez a megoldás nem igényel extra próbákat (oligo, primer), ezért a
relatíve olcsósága miatt népszerű.
EXTRA KÖVETELMÉNY A TaqMan módszerrel még pontosabban
meghatározható a minta DNS tartalma. Maga a próba egy 20-30 bp hosszúságú
oligonukleotid, mely a felamplifikálni kívánt DNS szakasz egy, a közepén lévő régiójával
komplementer. A próba a két végén módosított: 5’ vég: fluoreszcens festék molekulával
jelölt → reporter (R). 3’ vég: a reporter fluoreszcenciáját kioltó, nem fluoreszcens quencher
(NFQ) molekulát tartalmaz
A próba intakt állapotában a kioltó molekula a reporterhez való fizikai közelségéből
kifolyólag képes a reporter fluoreszcens emisszióját kioltani. Az energia átadás fluoreszcens
rezonancia energia transzferrel ( FRET) történik és a két molekula fizikai közelségén alapul. A
TaqMan alapú PCR reakcióhoz, az amplifikáció működéséhez három oligonukleotid egyidejű
bekötődése szükséges, mely a nagyfokú specificitást biztosítja. Az amplifikáció során a DNS
polimeráz 5’-exonukleáz aktivitásának köszönhetően képes a próbát hasítani, miáltal a
reporter távolabb kerül a kioltó molekulától, amely így már nem képes elnyelni a reporter
által emittált fluoreszcenciát. A reakció előrehaladtával egy detektor folyamatosan érzékeli
az exponenciálisan* növekvő fluoreszcenciát, ami arányos az adott minta kiindulási RNS
(cDNS) tartalmával, a vizsgálni kívánt gén expressziójának mértékével. * ideális PCR reakciók
esetén figyelhető meg az exponenciális növekedés: n-edik ciklus kópiaszáma 2
n
EXTRA KÖVETELMÉNY OLVADÁSPONT-ANALÍZIS A PCR TERMÉKEK
ELEMZÉSÉRE - MINŐSÉGI ANALÍZIS: Minden DNS fragmentumra jellemző az olvadáspontja
(Tm), mely definíciószerűen az a hőmérséklet, melyen az adott DNS fragmens 50%-a
egyszálú. Az olvadáspontot leginkább befolyásoló tényezők: a fragment G+C tartalma,
valamint hossza. A készülék a hőmérséklet fokonkénti emelése közben képes folyamatosan
monitorozni a keletkező fluoreszcenciát. Amikor a kapillárisban a hőmérséklet eléri a vizsgált
fragmens Tm értékét, a fluoreszcencia emisszió hirtelen csökkenni kezd, az alkalmazott
fluoreszcens technikától függően, vagy azért, mert a (duplaszál-specifikus) SYBR Green I
leválik az amplikonról, vagy azért, mert a hibridizációs próbák az amplikonról leolvadva már
nincsenek többé megfelelő közelségben.
13
Mire használható az olvadáspont analízis? (1) mutáció detektálására, mivel a próba és a
target közötti mismatch a Tm csökkenését okozza, (2) termékek megkülönböztetésére,
mivel a rövidebb termékek (pl. primer-dimerek) Tm értéke alacsonyabb mint a specifikus
fragmenté,(3) a termék azonosítására, a termékspecifikus Tm érték kimérésével.
EXTRA KÖVETELMÉNY ANALÍZIS II – MENNYISÉGI ANALÍZIS: A Real-Time
PCR reakciók során keletkező termékek mennyiségi kiértékeléséhez szükség van a Ct
(threshold cycle; küszöbfluoreszcencia) fogalom ismeretére. Minden egyes Real-Time PCR
reakciónak van egy adott Ct értéke; mely az a ciklusszám, ahol az adott mintából származó
fluoreszcens jel az ún. háttérfluoreszcencia (zaj) szintje fölé emelkedik. Zaj: a kezdeti
ciklusokban nem a speifikus termékekből származó fluoreszcencia.
EXTRA KÖVETELMÉNY REAL-TIME PCR A GYAKORLATBAN – SNP
DETEKTÁLÁS: SNP-k detektálásához a TaqMan alapú Real-Time PCR használható. Az allél
specifikus PCR-nál megismert módon, az egyik primert itt is úgy tervezzük, hogy 3’-vége az
SNP-re essen. A DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3’-vége az
SNP-vel komplementer, s ebben az esetben a reporter festék fluoreszcenciája detektálható
lesz.
EXTRA KÖVETELMÉNY REAL-TIME PCR A GYAKORLATBAN – EXPRESSZIÓ
VIZSGÁLAT A chipekhez hasonlóan a Real_time PCR is a génexpressziós vizsgálatokban
rendkívül hasznos. Ugyanúgy összehasonlíthatjuk vele a kezelt és kezeletlen, beteg és
egészséges minták génexpersszióját. A limitáló tényező, hogy egyszerre jóval kevesebb
mintáról kapunk információt, viszont a microarray-hez képest jóval érzékenyebb technika.
Két minta Ct értéke közti különbségből (∆Ct) meghatározható a relatív kópiaszám (egyikben
hányszor több kópia van, mint a másikban).
FAKULTATÍV ANYAG RACE: Rapid Amplifiation of cDNA Ends (cDNS
végek gyors felszaporítása): Módszer a cDNS-ek elejének és végének azonosítására. Az RNS-t
reverz transzkripcióval (RT) cDNS-sé írjuk, majd PCR-rel felamplifikáljuk. A cDNS kópiákat
megszekvenáljuk. Megkülönböztetünk 5’ és 3’ RACE-PCR módszert. 5’ RACE esetén az mRNS
5’-végéhez tapadó ún. génspecifikus primert használunk a reverz transzkripcióhoz. Ezután
egy enzimmel (tDt: terminális dezoxinukleotid transzferáz) egy homopolimer „farkat”
(azonos nukleotidokból áll) adunk a cDNS 3’ végére. A PCR során egy másik génspecifikus
primerrel és a „farokkal” komplementer primert használunk a felamplifikáláshoz. 3’ RACE
során a reverz transzkripciókor kihasználjuk az mRNS-ek 3’ végén lévő PolyA farkat (csupa T-
ből álló OligodT primert használunk), ezért nincs szükség tDt-re. A PCR-t egy génspecifikus
primer, s egy az OligodT-vel komplementer (csupa A) primerrel végezzük el.
FAKULTATÍV ANYAG SAGE: Serial Analysis of Gene Expression
(Génexpresszió sorozatvizsgálat): nagyszámú transzkriptum egymás melletti analízisére
alkalmas. A módszer alapvetően két alapfeltevésen nyugszik: (1) egy rövid (kb 10-14
bázispár) nukleotidszekvencia-részlet elég információt tartalmaz ahhoz, hogy egy géntermék
azonosítható legyen, (2) ezeknek a rövid szekvenciarészleteknek az egymásutáni láncolata
lehetővé teszi sok géntermék egymásmelletti hatékony analízisét. A módszer során olyan, 9-
10 bázispár hosszúságú, úgynevezett SAGE-címkéket (tag-ek) kapunk, amelyek egy adott
mRNS-populációt tükröznek. A technikának az az előnye, hogy segítségével a különböző
kísérleti körülményekből származó mRNS-populációk között szignifikáns mennyiségi reláció
14
állítható fel. Érzékeny az alacsony kópiaszámú géntermék kimutatásában. A DNS-csipek
előfutárának tekinthető, azonban időigényessége miatt ez a módszer mára jelentősen
háttérbe szorult. A módszer lépései röviden a következők: (1) mRNS izolálás (2) mRNS
kihorgonyzott OligodT-hez kapcsolása (PolyA-ja révén) (3) cDNS írás (RT) (4) Emésztés egy
restrikciós endonukleázzal (RE); csak a kihorgonyzott részre lesz szükségünk (5) Egy RE
hasítóhelyét tartalmazó adaptert ligálunk hozzá (olyan RE-t használunk, mely a felismerő
helyéhez képest beljebb hasít)(6) Az előbb használt RE-vel megemésztjük (7) Az így kapott kis
cimkéket (tag-eket) kettesével összeligáljuk (ditagek képződnek) (8) Ditagaket felszaporítjuk
PCR-rel (9) Leemésztjük a végükről a hasítóhelyet tartalmaző adaptereket (10)
Konkatamerekké ligáljuk össze és megszekvenáljuk.
Komparatív (összehasonlító) genomika: az a tudományterület, mely a
különböző fajok genom struktúrája és funkciója közti hasonlóságokat vizsgálja. A genom
szekvenálás eredményei lehetővé teszik, hogy az egyes élőlények genomjait géntartalmuk és
a gének szerkezete szerint összehasonlítsák. Egyes fajokon belül is lehet összehasonlításokat
tenni. A vizsgálatok eredményiből a gének szerepére és evolúciójukra lehet következtetni. Ha
egy bizonyos genom szekvencia, vagy mintázat egy adott, közös leszármazási vonalú
(monofiletikus) rendszertani kategória tagjai között gyakori, akkor konzervatív szekvenciáról
beszélünk. Egy-egy ilyen szekvencia, azaz motívum evolúciós konzerváltsága arra utal(hat),
hogy szelekciós előnyhöz juttatja az ezzel rendelkező élőlényeket. A konzervatív szekvenciák
kifejeződhetnek, mint fehérjék, de lehet, hogy szabályozó szerepet töltenek be. Találtak
olyan konzervált DNS-szakaszokat is, melyekről RNS leíródik, de fehérje nem képződik. Ezek
szerepe még nem tisztázott (valószínűleg szabályozó RNS-ekről van szó). Hasonló
szekvenciák azonosítása (géneket is beleértve) távoli rokon élőlényekben (nem
monofiletikusak), ahhoz a feltevéshez vezet, hogy ezekre az egyikük horizontális
géntranszferrel tett szert. Ez a jelenség baktériumok körében gyakori, de
magasabbrendűeknél is előfordul. Eukarióta genomokban is jelen lehetnek prokarióta
eredetű gének. Ezek mitokondriális (vagy növények esetében színtestek) felépítésében
résztvevő fehérjéket kódolnak, az endoszimbionta elméletet támasztva alá. Számos
genomikai vizsgálatot végeztek, melyek az emberi agy kialakulásának megértését tűzték ki
célul.
EXTRA KÖVETELMÉNY MYH16 (miozin nehézlánc kódoló gén) : egy
philadelphiai klinikán azt találták, hogy bármely populációból származó minden emberben az
MYH16 géneknek két DNS-bázisa hiányzik, ha összehasonlítjuk bármely más főemlős hasonló
génjeivel, tehát redukció történt. A főemlősökben található változat a hosszú, eredeti verzió
előfeltétele volt annak, hogy erős rágóizom fejlődjön ki. Ez a nagy rágóizom, amely szükséges az
egész napos táplálkozásnál (ez a nagyizom a csimpánznál is megtalálható), a halántéki csonton
található nagy csontkiemelkedéshez kapcsolódik. Anatómiai tanulmányok arra utalnak, hogy ez
az extra csontmegnagyobbodás valamilyen módon gátló kapcsolatban van az agykoponya
kiterjedésével és az agykoponya csontjai között található növekedési gócokkal: s ezek
növekedésgátlásán keresztül gátolja az agykoponya, s az agy fejlődését is. A mutáció során
kialakuló, emberi gén egy rövidebb gén, mely kevesebb rágóizom-fehérjét termel, így csökken a
rágóizom nagysága is. Emiatt nem szükséges extra csontkiemelkedés a koponyán, tehát
felszabadítja a koponyát a növekedését gátoló tényező alól. Tehát növekedhet a koponya, így az
agyunk is. Kutatók a vizsgálatok alapján azt gondolják, hogy ez a mutáció, amelyet a „gondolat
szobájának” neveztek el, kb. 2,4 millió évvel ezelőtt jött létre, éppen Homo nemzetség
fejlődésének egy olyan szakaszában, amikor ezzel párhuzamosan felgyorsult az agy fejlődése is.
15
EXTRA KÖVETELMÉNY FOXP2 (forkhead box protein P2): a „ beszéd
génje”. Az a protein, amelyet kódol, szinte azonos az egérben, csimpánzban és az emberben.
A 715 aminosavból két aminosav különbözik a csimpánz és az ember között. (Az egér és a
csimpánz között csak néma mutációk vannak). A kutatók szerint a FOXP2 génnek ez a
humánspecifikus mutációja kb. 50-100 000 évvel ezelőtt jött létre. Ez a mutáció teszi
lehetővé azokat a finom mozgásokat, amelyek szükségesek ahhoz, hogy motorikusan
létrejöjjön a beszéd. Ilyen módon a FOXP2 gén kis mutációja jelentős mértékben hozzájárult
a beszéd és a nyelv kifejlődéséhez.
EXTRA KÖVETELMÉNY HAR (Human Acceleraled Region): nagyon
felgyorsult evolúciós változáson ment át az emberelődökben és az emberekben, s különösen
aktív az agyfejlődés kritikus szakaszában. Összehasonlították a csimpánzok és emberek
genomjait, kiderítették, hogy kb. 48 olyan terület található a humán emberi genomban,
amelyek különösen gyorsabban fejlődtek, mint
a csimpánz vagy más állatok ugyanazon 48 régiója. Az egyik régió ezek közül a HAR. Az
elemzések során kimutatták azt is, hogy a HAR1 lényegében ugyanaz minden emlősben,
kivéve az embereket. Ez a hasonlóság azt jelenti, hogy ez a DNS-szekvencia tulajdonképpen
változatlan maradt százmillió éveken keresztül az evolúció során, ami egyben azt is jelzi,
hogy egy biológiailag rendkívül fontos funkciót lát el. Abban az időben azonban, amikor az
emberi vonal szétvált a csimpánzzal közös elődtől, kb. öt-hétmillió évvel ezelőtt, a HAR1
elkezdett változni, sokkal gyorsabban, mint azelőtt. Egyáltalán, míg azelőtt nem volt lényegi
változás, most rendkívüli módon változott: 18 különbséget találtak a csimpánz és a humán
HAR1 DNS-e között, ami fantasztikusan gyors és nagy változás, különösképpen figyelembe
véve azt, hogy néhány millió év alatt játszódott le. Különösen fontos e tekintetben az, hogy a
neokortexnek az első része a prefrontális, vagyis előhomloki lebeny, kortex, rendkívüli
módon, hatalmasra fejlődött a hominid evolúcióban, az ember fejlődése során.
Genom és komplexitás (lásd I. félév, Genom c. előadás) 2009-re már több
mint 50 eukarióta genom nukleotid sorrendjét olvasták le. Szinte minden „completly
sequenced” genom tartalmaz hiányokat, nem szekvenált szakaszokat. Ezek főként
heterokromatin szakaszok. Ezért a genomok mérete, DNS tartalomban és génszámban
egyaránt becslésen alapszik. Az eukarióta genomok DNS tartalma nagyobb, mint a
prokariótáké. Az egyes eukarióták komplexitása és genomjuk DNS tartalma vagy génjeik
száma között nincs szoros összefüggés. Például a lúdfű genomja nagyobb a bonyolultabb
C.elegans genomjánál. A muslica komplexebb élőlény, mint a C.elegans, de a fonálféregnek
több génje van, mint a muslicának. Az ember vagy az egér és a fugu halnak körülbelül
ugyanannyi génje van, de a fugu genom DNS tartalma csak kb. tizede az egér vagy ember
genomjának.
Humán genom csak szemléltetés
Eukarióta genomok Sejtmagi, mitokondriális és kloroplasztisz genom.
Ismétlődő genetikai szegmensek, transzpozonok, stb. Az emberi genom struktúrája
gyakorlatilag 100-osan ismert (egy prototípus), azonban a gének funkciójáról jóval kevesebb
az ismeret. A jövő a genomika és a bioinformatika alapján új utat jelöl ki az orvosbiológia
fejlődésében, a megelőzésben, diagnosztikában és a gyógyításban, gyógyszer-, védőoltás-
fejlesztésben egyaránt. A bioinformatika és a genomika révén jelentősen nő az esély az
életminőség javítására, az átlagéletkor emelésére.
Dostları ilə paylaş: |