7
A DNS-chip nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű
meghatározására szolgál. Egyetlen chip 6-10000 gén szimultán vizsgálatát teszi lehetővé.
Működésük alapja a DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció. A DNS-chip-ek a próbák minősége
alapján két csoportra különíthetők el: (1) cDNS chipek: mRNS-ről reverz transzkripcio
segitsegevel, in vitro előallitva; (2) oligonukleotid chipek (20-25 bp)
FAKULTATÍV ANYAG
A DNS-CHIP KÉSZÍTÉS I: FOTOLITOGRÁFIA (IN SITU , azaz helyben
szintetizált chip): ún. fotolitográfiai módszerrel szintetizálják a próbákat a hordozó
felszínére. E módszer egy magyar származású kutató, Steven Fodor ötlete. A módszer elve
az, hogy az üres lapocskát fényre bomló anyaggal borítják, majd egy olyan maszkkal fedik le,
amely miniatűr (< 1 mikron) átmérőjű, bizonyos pontokon perforált kis lyukak ezreit
tartalmazza, előre megtervezett eloszlásban. Ha ezt követően fénnyel világítják meg a
maszkkal fedett lapocskát, csak ott jön le a fotolabilis anyag, ahol a kis lyukak helyezkedtek
el. Ezzel egyidejűleg az egyik a fotolabilis molekulával kapcsolt nukleotidot (pl. A) hozzáadják
a rendszerhez, amely így kapcsolódni képes a fény által szabaddá tett pozícióhoz. Ugyanezt
három másik, más perforációs mintázatot hordozó maszkkal (C, T, G) megismételve a teljes
lapocska fedve lesz kötött nukleotidokkal. Minthogy a nukleotidok fotolabilis anyagot
hordoznak, további négy maszk egymásutáni adásával, megvilágítással és a megfelelő
nukleotid adagolásával felépíthető a második, harmadik, stb. "emelet", Tehát, például egy 10
"emeletes" oligonukleotid 10 x 4=40 maszkot, negyven megvilágítást és minden negyedik
ciklusban ugyanazzal a nukleotiddal való inkubációt jelenti. Ez nem több mint ciklusonként
egy perc, tehát példánkban 40 perc alatt készül el egy gén-chip. Minthogy a maszkok
perforáltsági mintázatát a számítógép tervezi, az tudni fogja, hogy mely pozíción milyen
"emeletek" következtek egymás után tehát az in situ szintetizált oligonukleotid szál
sorrendjét. Így már az is érthető, hogy a leolvasáskor (lásd előző rész) az egyes pontok
pozitivitása milyen génnek, mely génszakasznak felelt meg. Az előállítás tehát úgy történik,
hogy a gyártó betáplálja azokat a génsorrendeket a számítógépbe, amelyekre kíváncsi (pl.
vírusok egyedi génjeit, tumort okozó mutációkat, hisztokompatibilitási HLA-molekulák
jellegzetes szakaszait, stb.) A számítógép ezek alapján megtervezi a maszkok perforáltságát,
sorrendjét és egy automata szintetizátor létrehozza a gén-chipet. Már ma is egy-egy gén-chip
előállítása igen olcsó és a kereskedelmi ár sem haladja meg a 100 USD-t.
A DNS-CHIP KÉSZÍTÉS II: „NYOMTATÁS”: egy kis lapocskára, szilárd
hordozó felületre (lehet üveg, speciális műanyag) robot segítségével (spotted microarray)
DNS-próbát visznek fel, akár 1 000 000 DNS-szálat. Ismert e DNS próbák szekvenciája
(nukleotidsorrendje) és helyzete is. Ez úgy lehetséges, hogy a számítógép "megjegyzi", hogy
a kétdimenziós rácson melyik pozícióban, milyen nukleotidszerkezet található. A DNS
kovalensen köt a hordozóhoz. Ezt követően ehhez a chiphez adják hozzá az in situ
hibridizációhoz hasonló módon egy oldatban a vizsgálandó személy (organizmus) sejtjeiből
izolált DNS- (illetve RNS-) darabokat (esetleg ezek polimeráz láncreakcióval (PCR)
felszaporított tömegét), melyet előzőleg fluoreszcens festékkel megjelöltek. Rövid inkubálás
után kimossák a nem kapcsolódó nukleinsavdarabokat. Könnyen belátható, hogy a megfelelő
színes nukleinsavdarabok csak oda kapcsolódnak, ahol az előbb említett nukleotidbázis
komplementaritás teljesül. Más szóval, úgy történik meg az inkubálás majd a mosás, hogy
csak azok a szálak kössék meg a nekik megfelelő jelzett nukleinsavdarabokat, ahol teljes a
sorrend azonossága. Ezt követően egy "scanning" rendszer leolvassa a színes és sötét
pontokból álló mintázatot és már csak az eredmények értékelése van hátra. Itt újra a
számítógépé a főszerep, hiszen az "tudja", hogy mely pozícióban milyen génszakasz
található. Ha például az egyik rácsponton a HIV jellegzetes génszakaszát helyezték el, és ott
pozitív reakciót jelez a leolvasó, ez azt jelenti, hogy a beteg mintájában előfordult ez a vírus.
8
HASZNÁLATA különböző mintákból a génexpressziók összehasonlítására: Több szín,
fluoreszcens festék alkalmazása lehetővé teszi, hogy ugyanazon fajta chip-ből az egyiket egy
kezelt pl. piros festékkel jelzett, a másikat pedig egy kezeletlen minta zöld festékkel jelölt
DNS-mintájával inkubálják Ebben az esetben a két mintából származó RNS-t reverz
transzkripcióval cDNS-sé írunk át. A cDNS-t felépítő nukleotidokat fluoreszcensen jelöljük: a
két RNS populáció átírására szolgáló nukleotidok jelöléséhez tehát két, spektrális
tulajdonságaiban egymástól különböző festéket használunk (a példában a kontroll mintából
származó RNS-ek átírásához zöld Cy3 festékkel jelölt nukleotidokat használunk, míg a kezelt
esetben piros Cy5 festéket)
pirosan és zölden fluoreszkáló cDNS-eket kapunk, amelyeket
egy DNS-chipen hibridizálva, majd egy nagyfelbontású lézerszkenneres leolvasás után
meghatározhatjuk az egyes gének relatív kifejeződése. A gén aktivitása az adott pontban
detektálható fluoreszcens jel intenzitásával arányos. Ha egy pontban a kezelt mintából
származó fluoreszcens jel erősebb, az azt jelenti, hogy a kezelés hatására az adott gén
aktivitása megemelkedett.
KIÉRTÉKELÉS A rendkívül nagyszámú mintakapcsolás kiértékelése
bonyolult programokkal és igen fejlett számítógépes technikával történik. A számítógép a
leolvasás után egymásra képes vetíteni a leolvasott mintázatokat. Ott, ahol mindkét esetben
(kezelt-kezeletlen, vagy beteg-egészséges, stb.) azonos a gén (illetve az ennek megfelelő
DNS-darab) szerkezete, a zöld és a piros egymásra vetülve sárga színt ad. Ahol hiányzik a
kezelt mintából a megfelelő DNS-szakasz, a zöld szín jelenik meg, ahol csak a kezeltben van
valamely DNS-szerkezet, ott a piros szín dominál. Így, mintegy kivonható egymásból a két
eredmény és a különbségre génszinten derül fény. Az eljárással képet kaphatunk egyes
gének föl-, illetve alulexpresszálódásáról. Egyes daganatokban expresszálódó gének, az ún.
génmintázat, a normálissal, illetve különböző daganattípusok egymással hasonlíthatók össze.
Ennek eredményeképpen a daganatok a génexpressziós profil alapján egymástól
elkülöníthetők.
A DNS CHIPEK FELHASZNÁLÁSA: (1)
Fertőzések felismerése,
mikroorganizmusok azonosítása. (2)Rákdiagnosztika: diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBLC)
típusok megkülönbözetése alkalmas kezelés. (3) SNP-kdetektálása.
(4) miRNS-microarray–különböző ráktípusokban megfigyelhető, hogy bizonyos miRNS-
ekalul/túlexpresszálódnak
FERTŐZÉSEK
DETEKTÁLÁSA:
a
jelenleg
ismert
genomú
mikroorganizmusok: vírusok, baktériumok, gombák teljes, specifikus génszekvenciája
felvihető a chipekre, s így pl. néhány csepp vérből kimutatható, hogy a vér „tulajdonosa”
mivel fertőzött. Nemcsak maga a mikroorganizmus, de a terápiás megoldás is
megközelíthető (pl. antibiotikum-rezisztencia spektrum) ezzel a módszerrel. Már jelenleg is
rendelkezésre áll a kereskedelmi forgalomban az a chip, amely a HIV-ellenes szerekkel
szembeni rezisztenciát mutatja ki.
EXTRA KÖVETELMÉNY DIAGNOSZTIKA: a microarray a betegségek
diagnosztizálásának jövőbeli fontos eszköze??? Egy amerikai kutatócsoport (Pat Brown &
David Botstein csoportja) és jó néhány más kutatóintézet kapcsolatot épített ki egymással
annak érdekében, hogy a DNS chipeket a diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBCL)
diagnosztizálására alkalmassá tegyék. A DLBLC a B-sejtek rendkívül agresszív, rosszindulatú
elváltozása. Az USA-ban évente kb. 25 000 új esetet jelentenek. A DLBLC diagnózisa
morfológiai és molekuláris jellegzetességek kombinációján alapul. Kemoterápiával a betegek