İlham Məmmədov, Aydın Əhmədov Nəcməddin Məmmədov
Yüklə 336 Kb. Pdf görüntüsü
|
rirsə reaksiya müsbət, zəif palıdı rəng - şübhəli və rəngsizlik - mənfi hesab edilir. Palıdı rəng qeyd edilən 1 q Ç-nin maksimal durultması onun titri hesab edilir. 2. Müsbət və mənfi antigenlərin 1 g G-və qevri-spesifik əla qəsinin titrasivası. Bu məqsədlə 1:2-dən 1:1024-ə qədər müsbət və mənfi antigenlərin durultma dərəcələri əldə edilir. 0,0125 ml həcmində hər bir durultmadan polistirol gözcüklərinə keçirilir və adsorbsiya məqsədlə 16-18 saat ərzində 40° S temperaturda saxlanır. Adsorbsiyadan sonra birləşmiş antigen gözcükdən kə nar edilir və 3 dəfə yuyucu buferlə yuyulur. Bundan sonra bufer qalığını kənar etmək üçün planşeti çalxalayırlar. Daha sonra ad sorbsiya olunmuş və duruldulmuş atigen olan gözcüyə işçi titr- dən götürülmüş 0,0125 mqlq G əlavə edilir və 45 dəqiqə ərzin də 37° S temperaturda inkubasiya edilir. Birləşmiş IqG-ni çalxa- lamaqla kənar edib, yuyucu buferlə 3 dəfə yuyulur. Sonra bunun üzərinə indikator sistemi buferi əlavə edilir. 30 dəqiqə inkuba- siyadan sonra nəticə yoxlanır. Hiperimmun seruma qarsı müsbət antigenlərin titrləşdiril- məsi. Kvadrat sxem əsasında atigeni hiperimmun serumla titrlə- dirirlər. Müsbət antigenin l:2-dən l :2048-ə qədər nisbətində durultmaları hazırlanır və şaquli xətt boyunca 1-dən 10-cu sıraya dək 96 gözlüklü planşetin gözcüklərinə əlavə edilir. 12-ci şaqu li sıraya mənfi antigenin 1:2-l:128-dək durultmaları tökülür. Bundan sonra adsorbsiya olunmaq məqsədilə planşet 4°S tempe raturda 16-18 saat saxlanır. Birləşməmiş antigenləri adsorbsiya dan sonra kənar edilir, sonra 3 dəfə yuyucu buferlə yuyulur. Sonrakı mərhələdə üfuqi sıra gözcükləri hansı ki, A, B, S, D, E, F, G, H hərfləri ilə qeyd edilir və hiperimmun serumun du- rultmasından 0,0125 ml miqdarında l:10-dən l:640-a qədərdən başlayaraq əlavə edilir və 37° S temperaturda 1 saat ərzində in kubasiya edilir. İnkubasiya qurtardıqdan sonra birləşməmiş spe sifik antitelləri çalxalamaqla kənar edilir. Yuyucu buferlə 3 də 74 fə yuma apararaq, qalıq buferi kənar etmək üçün çalxalanır. Sonra gözcüklərə işçi titrdə IqG hərəsinə 0.0125 ml miqdarıda əlavə edilir və yenidən 37° S temperaturda 1 saat inkubasiya edilir. İnku- basiyadan sonra gözcüklərlər çalxalanmaqla I q G-dən azad edi lir və 3 dəfə yuyucu buferlə yuyulur. Bufer məhlul əvvəlki qay da üzrə kənar edildikdən sonra gözcüklərə 0,0125 ml indikator sistemi buferi əldə edilir, 37° S temperaturda 30 dəqiqə inkuba siya edilir və reaksiyanın nəticəsi yoxlanır. Reaksiyanın nəticəsi yoxlanılan zaman ən əvvəl üfüqi H hərfi sırasına və Il-ci şaquli sıraya diqqət yetirilir. Bu sıraların bütün gözciiklərində boyanma qeyd edilməməlidir. Bundan sonra hiperimmun serumun mənfi artigenin durult- maları ilə birləşmə dərəcəsi müəyyən edilməlidir. l:2-dən 1:4- ə qədər reaksiyalarda mənfi və ya şübhəli olmalı, digər mənfi antigenlərin durultma dərəcələrində də reaksiya mənfi olmalı dır. Daha sonra müsbət atigen və hiperimmun serumun litrləş- dirmə nəticələrinin tam uçotu aparılır. Müsbət antigenin titri onun elə ən böyük durultma dərəcəsi hesab edilir ki, hiperimmun serumun maksimal durultması ilə müsbət reaksiya versin. Əsas təcrübənin qoyulması. Gözcüklərin şaquli sırasını A, B, S, D, E,F, G, H hərfləri ilə, üfuqi sırasını isə 1-dən 12-dək ərəb rəqəmləri ilə qeyd edirlər. Gözcüklərin şaquli А, В, C sırasına 1:2 - 1:4 mənfi antigen əlavə edilir, gözcüklərin üfüqi D, E, F, G sırasında isə işçi titrdə müsbət antigen tökülür. Sonra adsorbsiya məqsədilə planşeti 16- 18 saat ərzində 4° S temperaturda saxlayırlar. Bundan sonra bir- ləməmiş antigeni çalxalamaqla kənar edib 3 dəfə yuyucu bufer lə yuyurlar. Buferin qalığını planşeti süzgəc kağızına vurmaqla aradan götürürlər. Sonra A, D, G sıra vertikal gözcüklərə 1:10- də tətbiq olunan serum tökür В, E sıra gözcüklərinə isə 1:10-də hiperimmun müsbət serum, C, F sıra gözcüklərin isə 1:10-də 75 mənfi serum tökülür, 1 saat ərzində 37° S temperaturda inkuba- siya edilir. Sonra birləşməmiş kompanentləri sirkələm əklə kə nar edib 3 dəfə yuyucu buferlə yuyurlar. Gözcükləri planşeti süzgəc kağızına vurmaqla qurudurlar. Bundan sonra 1 q G-ni gözcüklərə töküb yenidən 30-60 dəqiqə ərzində 37° S tempera turda saxlayırlar. İnkubasiyadan sonra birləşməmiş kompanent ləri sirkələm əklə kənar edib 3 dəfə bufer məhlulu ilə yuyurlar. Gözcükləri əvvəlki qayda üzrə qurulduqdan sonra gözcüklərə indikator sistemi buferi əlavə edib reaksiyanın nəticəsi yoxlanır. D sırası gözcüklərinə və E sıra gözcüklərinə məhlulda inten siv boyanma A, B, C, F, G və H sıra gözcüklərində məhlulun boyanması, E sıra gözcüklərində isə boyanma və A, B, C, F, G və FI sıra gözcüklərində boyanmanın olmaması isə reaksiyanın mənfi olmasını göstərir. Radioimmunoloji analiz/RİA/. Radioimmunoloji analiz - vi rus və antitellin radioaktiv yodla nişanlanmasına əsaslanmaqla kliniki materiallardan antitel və virus agentlərinin vasitəsilə və vasitəsiz ayrılmasının sürətli variasiyasından ibarətdir. Bundan əlavə antitellərin maye fazada adsorbsiyasının rəqib metodun dan da istifadə edilir. Bütün bu modifikasiyalar vasitəsilə virus etiologiyalı xəstəliklərə görə epizootik vəziyyəti öyrənilir. Bu metod ciddi spesikfıkliyi, yüksək həssaslığı və xəstəliklərin sü rətli diaqnosikası ilə səciyyələnir. Radioimmunoloji analiz 3 üsulla aparılır: 1) bərkfazalı vasi- təli üsul, 2) bərkfazalı vasitəsiz üsul və 3) antitelin maye fazada adsorbsiyasının rəqib üsulu. RİA-nın bərk yazalı vasitəli üsulu. Yoxlanılan materialda müxtəlif virus antigenlər təyin edilir. Bu məqsədlə antitelləri bərk fazada yəni əvvəlcədən duruldulma titrində qaramal və ya yu murta albumini ilə, selikonla işlənmiş polistinol kiirəciklərində adsorsiya edirlər. Adsorrbsiya olunmuş antellərin üzərinə antigen kim qanın serumu, ağız suyu, tənəffüs yollarının ifrazatları və kal 76 istiffadə edilir. Qyed olunan axırıncı 3 materialı əvvəlcədən tə mizləyirlər, yəni N-asetilsisteyində duruldub, 30 dəqiqə ərzində sentrifuqadan keçirirlər. RH 6,0-10,0 olan şəraitdə yaxşı adsorb- siya gedir, fosfatlı və karbonatlı bufer məhlullarından istifadə edi lir. Otaq temperaturasında zülalın adsorbsiyası 6-10 saata başa gə lir, ancaq bir qayda olaraq qeyd olunan inkubasiyanı 18-24 saat müddətində həyata keçirirlər. Bundan sonra təyin olunan virusa spesifik və əvvəlcədən radioaktiv yodla/125/ nişanlanmış indika tor antitelləri əlavə edilir. Hiperimmun serumu ada dovşanlarını və ya hind donuzlarını təmizlənmiş virionlarla /Nyukasl xəstəliyi virusu, qrip virusu/ və ya virus zülalları ilə, xüsusilə adenovrusla- rın nukleoproteinləri ilə immunizasiya etmək yolu ilə əldə edilir. 2 saylı cədvəldə heyvanların immunizasiya sxemi göstərilir. Cədvəl 2. Virus əleyhinə antitellərin alınm ası üçün heyvan ların im m unizasiya sxem i Vaxt günlə Freyindin tam ol mayan adyuvantı Virus materiallarının dozası mk q Hind donuzları Ada dovşanları 1 1 + 4 x 50 / d / a ) 4 x 75 / d / a ) 21 + 4 x 25 / d / a ) 4 x 50 / d / a ) 42 + 4 x 25 / d / a ) 4 x 50 / d / a ) 63 - 2 x 50 / ə / i ) 2 x 100/ v / d ) 6 8 - q a n s ı z l a ş d ı r m a q a n s ı z l a ş d ı r m a Analizin ikinci mərhələsində inkubasiya 37°S temperaturda 1 saata həyata keçirilir. Bundan sonra yoxlanılan və nəzarət nümunələrində radioaktivlik ölçülür. Nəzarət və mənfi sınaqlara nisbətən tədqiq olunan materialda radioaktivliyin 2-3 dəfə artması zamanı nəticə müsbət hesab edilir. RİA-ın bərkfazalı vasitəsiz üsulu. Bu üsul daha həssas ol maqla müxtəlif virusun antigenlərinin təyin üçün istifadə olu 77 Yüklə 336 Kb. Dostları ilə paylaş:
|