Probiotika, prebiotika a synbiotika

3.7.Smíšené biofilmy

V laboratorních podmínkách jsou biofilmy většinou studovány jako monokultury, protože v tomto případě jsou výsledky snáze reprodukovatelné. V přirozeném přírodním prostředí však často vznikají biofilmy smíšené,v nichž se vedle sebe v těsné blízkosti vyskytují různé druhy mikroorganismů. Tyto biofilmy byly nalezeny např. v rostlinné rhizosféře (Ramey a kol. 2004), ve střevech (Eckburg a kol. 2005) i ústní dutině (Filoche a kol. 2010). Mikroorganismy v nich mezi sebou soupeří o přítomné substráty, ale objevují se i komenzální a mutualistické vztahy (Goller a Romeo 2008). Častější sdílení genů konjugací i transformací a regulace fyziologických pochodů u buněk v biofilmu umožňuje lepší přizpůsobení měnícím se poměrům v okolním životním prostředí, tedy mimo jiné také rychlejší šíření faktorů virulence a rezistence ke stresu, tedy i ATB (Molin a Tolker-Nielsen 2003).

3.8.Studium biofilmů

Studium biofilmu probíhá na makroskopické i mikroskopické úrovni. Ani jeden z těchto způsobů však není ideální. Mikroskopický výzkum skýtá problémy s extrapolací dat získaných z malé části na celý systém (biofilm), na makroskopické úrovni, např. při měření všeobecných vlastností biofilmu kultivovaného in vitro, je zase obtížné vyhodnocovat získané výsledky, pokud nejsou velmi dobře definovány podmínky kultivace (van Loosdrecht a kol. 2002).

3.8.1.Mikroskopické techniky

Z mikroskopických technik užívaných pro studium biofilmů donedávna převažovaly metody popisné, jako studium architektury a struktury biofilmu pomocí různých druhů mikroskopie – světelné, rastrovací elektronové (scanning electron microscopy, SEM), transmisní elektronové (transmission electron microscopy, TEM), konfokální rastrovací laserové (confocal laser scanning microscopy, CLSM), mikroskopie atomárních sil (Stewart a kol. 1995), epifluorescenční (Donlan 2002) a time-lapse video mikroskopie či pomocí mikrosenzorů. V posledních letech však došlo k velkému rozvoji studia regulačních procesů i genů exprimovaných v jednotlivých vývojových stádiích biofilmu molekulárně biologickými metodami (Lemon a kol. 2008). Syntézu DNA nebo expresi bílkovin v jednotlivých vrstvách biofilmu lze zjistit pomocí TEM nebo CLSM, množství kyslíku při použití mikroelektrod (Werner a kol. 2004, Rani a kol. 2007).

3.8.2.Kultivační techniky

Při kultivaci biofilmu způsobuje těžkosti také nedostatek standardizovaných kultivačních metod. Navíc použitelnost těch dostupných je při řešení specifických výzkumných cílů omezená. Třeba metody vhodné pro mikroskopické hodnocení se již nehodí pro sběr biomasy biofilmu k dalším biochemickým měřením (Peterson a kol. 2011). Také přesná definice kultivačních podmínek je obtížná. Třeba v hydrodynamických reaktorech (systémech) vznikají na různých stranách povrchu substrátu jemné rozdíly ve smykovém napětí a mohou se objevit také gradienty živin a to i ve velmi dobře promíchávaných reaktorech, pokud je čas potřebný pro přeměnu živin kratší než doba nutná k promíchání (Gjaltema a kol. 1994).

3.8.2.1.Statická kultivace v mikrotitračních destičkách

(microtiter plate system)

Statická kultivace v mikrotitračních destičkách je jednou z prvních standardizovaných metod určených pro kvantifikaci tvorby biofilmu na abiotickém povrchu. Při krátké inkubaci (1 až 2 hodiny) lze hodnotit prvotní vazbu na povrch a při delší inkubační době (až 20 hodin) stanovit tvorba biofilmu (Peterson a kol. 2011). Tuto metodu vyvinul Christensen a kol. (1985) při studiu adheze koaguláza negativního zlatého stafylokoka (Staphylococcus aureus) na umělohmotný povrch. Od té doby však byla tato metoda upravena pro mnoho dalších druhů (Peterson a kol. 2011).

Kultivace probíhá přímo v mikrotitrační destičce. Připravená kultura se inokuluje do jednotlivých jamek s vhodným médiem a inkubuje za podmínek vhodných pro daný druh mikroorganismu. Poté se médium vylije, biofilm na stěnách jamek se promývá deionizovanou vodou a následně barví nespecifickým barvivem, např. krystalovou violetí (viz obr. 2). Barvivo se vyplaví ethanolem nebo jiným vhodným rozpouštědlem a odečte se hodnota absorbance v jednotlivých jamkách destičky (Peterson a kol. 2011).

Velkou výhodou této kultivace je relativní jednoduchost a snadné studium většího počtu kmenů (Peterson a kol. 2011). Navíc je v tomto systému možné rychle vyhodnotit velké množství vzorků najednou (Lemon a kol. 2008). To umožňuje využití metody při sledování mutantů s poruchami ve schopnostech adheze nebo při hodnocení účinků různých léčebných postupů, sloučenin či vlivu faktorů vnějšího prostředí na adhezi i tvorbu biofilmu daného mikroorganismu. Pomocí kultivace v mikrotitračních destičkách lze také zkoumat účinky povrchových vlastností substrátu na adhezi. Naopak nevhodná je tato technika pro studium struktury biofilmu a jeho rezistence k antimikrobiálním látkám, protože je obtížné takto kultivovaný biofilm mikroskopicky zobrazit a navíc po barvení rozlišit živé buňky a matrix biofilmu (Peterson a kol. 2011).

Jones a Versalovic (2009) kultivovali různé humánní izoláty Lactobacillus reuteri v polystyrenové mikrotitrační destičce v de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) médiu 24 hodin anaerobně při 35 ºC. Krystalová violeť byla po obarvení biofilmu vyloužena ethanolem a pomocí spektrofotometrických hodnot absorbance byla zjištěna kvantita vytvořeného biofilmu. Všechny studované kmeny tvořily biofilm, který se však mezi nimi lišil svou kvantitou. Kubota a kol. (2008) pomocí této techniky sledovali růst a tvorbu biofilmu u tří druhů laktobacilů, L. plantarum subsp. plantarum, L. brevis a L. fructivorans. Kultivace probíhala v MRS bujónu při 35 ºC jeden až dva dny za aerobních i anaerobních podmínek. Tyto kmeny byly kultivovány také aerobně na skleněných krycích sklíčkách umístěných v jamkách destičky a poté analyzovány SEM. Vznik biofilmu byl pozorován u všech tří druhů u obou kultivačních technik, jeho struktura se však mezi druhy lišila. Hancock a kol. (2010b) tuto metodu použili při studiu biofilmu probiotických kmenů Escherichia coli Nissle 1917 a 83972 a uropatogenní E. coli CFT073. Kultury předkultivované v lidské moči, LB (lysogeny broth či Luria-Bertani) nebo MOPS médiu byly v destičce s jamkami s plochým dnem kultivovány přes noc při 37 ºC. Také zjišťoval vzájemnou kompetici těchto kmenů při společné kultivaci vždy dvou z nich. Změny v počátečním poměru inokulovaných suspenzí 1:1 byly stanovovány počtem CFU. Pozorované kmeny tvořily biofilm ve všech třech kultivačních médiích. Kvantita narostlých biofilmů a schopnost kompetice byla rozdílná u kmenů i různých médií.

Mikrotitrační destička může být také potažena vrstvou biotických substrátů, např. mucinem, fibrinogenem, fibronektinem či kolagenem. Adhezi k těmto substrátům studovali Muñoz-Provencio a kol. (2009) u různých kmenů Lactobacillus casei. Kmeny byly inkubovány přes noc ve fosfátovém pufru (phosphate buffered saline, PBS) při 4 ºC. Krystalová violeť z nabarvených adherovaných buněk byla uvolněna citrátovým pufrem a byla stanovena její absorbance při 595 nm. Kmeny L. casei adherovali k mucinu, kromě tří kmenů, špatně nebo dokonce vůbec. Adheze k fibrinogenu, fibronektinu a kolagenu byla prokázána u všech kmenů, míra této schopnosti se však mezi kmeny lišila. Haukioja a kol. (2006) a Nagaoka a kol. (2008) použili mikrotitrační destičky s vrstvou slin ke studiu adheze bifidobakterií v ústní dutině.

Biofilm se tvoří při statické kultivaci také na rozhraní kapaliny a vzduchu. Tyto biofilmy se nazývají jako plovoucí pelikuly a tvoří je některé bakteriální druhy, např. Bacillus subtilis (viz obr. 3) (Branda a kol. 2005), Pseudomonas aeruginosa (Friedman a Kolter 2004) a Vibrio parahaemolyticus (Güvener a McCarter 2003). Jsou vhodné pro studium genů a mutací ovlivňujících tvorbu biofilmu (Güvener a McCarter 2003, Friedman a Kolter 2004, Branda a kol. 2005).

3.8.2.2.Kultivace na hrotech proti kusu mikrotitrační destičky

(cultivation on peg lids)
Metoda kultivace biofilmu na hrotech proti kusu mikrotitrační destičky je blízká kultivaci v mikrotitrační destičce. Roku 1999 popsal Ceri a kol. tzv. Calgary Biofilm Device (CBD), který tvoří polystyrénové víčko s 96 hroty (viz obr. 4) a standardní mikrotitrační destička s 96 jamkami. Biofilm se tvoří na hrotech proti kusu mikrotitrační destičky a na konci kultivace je pomocí ultrazvuku uvolněn do nového média. Hroty jsou obvykle vyrobeny z neupravovaného polystyrénu a mají neutrální elektrostatický náboj. Plast však lze pokrýt i další vrstvou z materiálu, který umožní adhezi náročných a jinak neadherujících mikroorganismů, např. lidským sérem, methylcelulózou nebo různými slitinami kovů. Tato vrstva může měnit povrchovou hydrofobicitu a poskytovat specifická vazebná místa pro různé humánní nebo rostlinné patogeny. Snadné přemisťování víčka mezi mikrotitračními destičkami také umožňuje paralelní srovnávání vlivu různých růstových podmínek na tvorbu biofilmu (Peterson a kol. 2011).

Na tuto techniku kultivace mohou navazovat další metody jako barvení biomasy, testování metabolické aktivity a počítání živých buněk, především je však používána pro kvantitativní hodnocení účinků různých antibiotik na růst a přežití bakteriálních buněk v biofilmu (Peterson a kol. 2011). CBD je využitelné pro testování multirezistence i zjišťování vlivu různých chromozomálních genetických elementů na tvorbu biofilmu (Harrison a kol. 2009). Velkou výhodou je také snadné oddělení celých hrotů od víčka, což poskytuje další možnosti měření a také využití mikroskopie. Největším záporem této kultivační techniky je omezené množství biomasy, která se může na hrotech vytvořit (Peterson a kol. 2011).

Kultivaci na hrotech destičky proti kusu mikrotitrační destičky lze provádět také za dynamických podmínek. Destičky s víčkem se často umisťují na gyrorotační třepačky nebo výkyvná zařízení, což vyvolává hydrodynamický vliv tekutiny na vznikající biofilm (Harrison a kol. 2006).

CBD použili Lebeer a kol. (2007b) ke studiu tvorby statického biofilmu u probiotického kmene Lactobacillus rhamnosus GG. Inkubace probíhala tři dny při 37 ºC za anaerobních nebo mikroaerobních podmínek. Vytvořený biofilm byl barven krystalovou violetí, která z něj byla následně uvolněna směsí ethanol-aceton (80:20) nebo v případě silného biofilmu 30% ledovou kyselinou octovou. Optická hustota v každé jamce byla měřena při 570 nm. Rychlost vzniku biofilmu a jeho kvantita se lišila mezi třemi použitými médii, MRS, mTSB (modified trypticase soy broth) a Lactobacilli AOAC (folic acid medium).

3.8.2.3.Kultivace na pevném nosiči

Při této metodě kultivace je statický biofilm pěstován na polopropustném polykarbonátovém filtru, který je umístěn na vhodném pevném médiu. Filtr umožňuje snadnou manipulaci s biofilmem a přemisťování z jednoho média na jiné. Biofilm se tvoří na rozhraní vzduchu a pevného povrchu a nemusí být zcela ponořený v kapalině. Při studiu pohyblivých kultur lze filtr umístit do kazety, do níž se vstříkne bakteriální suspenze. To umožní růst biofilmu na celém povrchu filtru (Peterson a kol. 2011).

Tato technika kultivace je velmi výhodná pro hodnocení citlivosti/rezistence k ATB. Citlivost může být buď kvantifikována jako počet živých buněk tvořících kolonie (CFU, colony forming units) nebo může být stanoven relativní průchod ATB biofilmem. V tomto případě je na vrchol biofilmu položen druhý, menší polykarbonový filtr a navlhčený papírový disk. ATB difundují z agaru skrz biofilm a filtry do papírového disku, v němž je pak stanovena relativní koncentrace daného antibiotika. Ke stanovení citlivosti/rezistence k antimikrobiálním látkám lze využít i kultivaci na víčku s hroty (viz kap. 3.8.2.2.) nebo v průtokové kyvetě (viz kap. 3.8.2.4.). Oproti těmto technikám je výhodou kultivace na pevném médiu pomocí CFU snadné a jednoznačné stanovení úmrtnosti buněk, které tak nemůže být zaměňováno s přirozeným odlučováním buněk z biofilmu v tekutině (Peterson a kol. 2011).

Syntézu DNA nebo expresi bílkovin v jednotlivých vrstvách biofilmu lze zjistit mikroskopicky pomocí TEM nebo CLSM a množství kyslíku při použití mikroelektrod (Werner a kol. 2004, Rani a kol. 2007).

3.8.2.4. Kultivace v průtokové kyvetě (flow cell chamber system)

Kultivace biofilmu v průtokové kyvetě je kultivací v hydrodynamickém in vitro systému, kde jsou bakterie přímo vstříknuty do průhledné kyvety, v níž jsou dále kultivovány. Kyvetou neustále protéká čerstvé sterilní médium, které napomáhá růstu bakterií adherovaných na povrch a odnáší s sebou jejich metabolity a neadherované planktonní buňky. Tento systém tvoří zásobník s kultivačním médiem, peristaltické čerpadlo, lapač bublin, spojovací silikonová trubice, kyveta, v níž je kultivován biofilm, a odpadová nádoba. Pro jednotlivé bakteriální druhy je nutné empiricky zjistit vhodné kultivační podmínky, mezi než patří třeba volba růstového média a povrchové úpravy kyvety, průtoková rychlost média, inkubační teplota a velikost inokula. V kyvetě je v průběhu kultivace díky laminárnímu proudění udržováno homogenní a konstantní prostředí, které se však liší od dynamiky prostředí reálného, proto je obtížné, jako u všech uměle vytvořených systémů, takto in vitro získané výsledky použít pro hodnocení in vivo (Peterson a kol. 2011).

Při použití různých fluorescenčních bílkovin a barviv tento systém umožňuje studovat růst jednotlivých buněk i uspořádání biofilmu v reálném čase (Peterson a kol. 2011). S fluorescenčními reportérovými geny je také možné v biofilmu sledovat genovou expresi, při jejíž aktivitě je fluorescenční signál vyhodnocován pomocí epifluorescenční mikroskopie nebo CLSM (Stewart a Franklin 2008). Kultivační kyvetu lze také potáhnout vrstvou biologických molekul pro studium interakcí mezi patogenním mikroorganismem a hostitelem (Peterson a kol. 2011).

Nevýhodou tohoto způsobu kultivace je, že nelze vyhodnocovat více vzorků najednou. Velmi obtížný nebo často dokonce nemožný je také odběr biomasy biofilmu z kyvety pro další rozbor. Pro tyto účely lze místo kyvety pro kultivaci biofilmu použít silikonovou trubici či rotační diskový reaktor (viz kap. 3.8.2.5.). Kultivace v trubici umožňuje akumulaci velkého množství biofilmu, který lze z její stěny snadno seškrábnout. Biomasa pak může být dále využita při biochemickém a genetickém testování (Peterson a kol. 2011).

Jones a Versalovic (2009) ve skleněné kyvetě kultivovali kmeny Lactobacillus reuteri. Kultivace probíhala v proudícím MRS médiu při 37 ºC po 24 a 48 hodin. Vytvořený biofilm byl po obarvení akridinovou oranží pozorován technikou CLSM. Pomocí CLSM byly hodnoceny také biofilmy vytvořené dvěma probiotickými kmeny a uropatogenním kmenem Escherichia coli v moči při 37 ºC (Hancock a kol. 2010b). Millsap a kol. (1997) tento způsob kultivace využili při studiu adheze různých druhů laktobacilů v moči nebo PBS pufru na sklo a silikonovou pryž, které byly upevněny na dno paralelních kyvet. Kyvety byly umístěny na stolek světelného mikroskopu a biofilm fotografován pod fázovým kontrastem. Ze studovaných kmenů pouze u dvou, L. acidophilus ATCC 4356 a L. fermentum B54, byla adheze na oba povrchy významná. Tannock a kol. (2005) pomocí kultivace v MRS médiu na plastových kuponech vložených do kyvety sledovali vliv genu luxS na biofilm tvořený kmeny L. reuteri a jejich mutantními homology. Po inkubaci kupony z kyvety vyjmuli, biofilm nabarvili akridinovou oranží a pozorovali přes laserový rastrovací mikroskop jako v prvním případě Jones a Versalovic (2009). U stejných kmenů sledovali pomocí CLSM, pro kterou bylo použito komerční barvivo BacLight Green (Molekular Probes, Oregon), také rozdíly v tvorbě biofilmu na epitelových buňkách myšího žaludku.

3.8.2.5.Rotační diskový a koncentrický válcový reaktor

Rotační diskový reaktor (rotating disc reactor, RDR) a koncentrický válcový reaktor (concentric cylinder reactor, CCR) slouží ke kultivaci biofilmu pod různě velkým smykovým napětím v konstantním proudu média. RDR tvoří kruhový disk s vyjímatelnými kupony, jež mohou být vyrobeny z řady materiálů. Disk je připevněn k magnetu a vložen do skleněné nádoby s kapalným kultivačním médiem. Ta stojí na magnetickém míchadle, které vyvolává hydrodynamické pohyby kapaliny kolem disku (Peterson a kol. 2011). CCR se skládá ze čtyř soustředných komor, v nichž jsou umístěny čtyři válce z nerezové oceli, které se mohou točit různou rychlostí. Čerstvé médium je určitou rychlostí kontrolovanou peristaltickou pumpou dodáváno do každé komory samostatně. Toto uspořádání umožňuje tvorbu biofilmu s konstantním přísunem živin a různým smykovým napětím na každém válci (Willcock a kol. 2000).

Na discích v RDR nebo válcích v CCR lze sledovat růst a životnost bakterií pomocí CFU v různých časových intervalech. Je také možné hodnotit vliv různých chemikálií na biofilm. Ty mohou být zavedeny přímo do reakční nádoby nebo dodávány postupně ze zásobní nádoby s proudícím médiem. Tak je možné napodobit dávkování v reálných léčebných postupech. Navíc kupony s vytvořeným biofilmem vyjmuté z RDR mohou být inkubovány přímo v potenciálních biocidech či léčivech. Podle počtu přeživších bakterií se následně může stanovit dávka účinná pro úplnou eradikaci či porušení biofimu.

Metody také dovolují srovnávat tvorbu biofilmu u různých kmenů nebo mutant měřením nahromaděné biomasy s ohledem na různá vývojová stádia biofilmu. Kupony lze potáhnout různými biologicky významnými substráty, biopolymery, materiály užívanými v implantátech (s různou antibakteriální úpravou) a dalšími složkami, se kterými může biofilm interagovat. Kupony s biofilmem by také mohly být implantovány do pokusných zvířat, kde by napodobovaly infekci při studiu infekčních chorob spojovaných s výskytem biofilmu. Největší nevýhodou těchto reaktorů je, že v nich nelze kultivovat více kmenů najednou (Peterson a kol. 2011).