Synthetic Biology Final Report

Synthetic Biology | State of the Art 
 
30 
Intact  synthetic  Mycoplasma  mycoides  genomes  from  the  sMmYCp235  yeast  clone  were  transplanted  into 
restriction-minus Mycoplasma capricolum recipient cells.  
To aid in testing the functionality of each 100 kb synthetic segment, semisynthetic genomes were constructed 
and transplanted. By mixing natural pieces with synthetic ones,  the successful construction of each synthetic 
100 kb assembly could be verified without having to sequence these intermediates (Gibson et al. 2010). 
It was also demonstrated that the progeny of this cell will not contain any protein molecules that were present 
in the original recipient cell. 
3.2.3
 
Modification on other level than DNA 
 Non-Natural Amino Acids (NNAA): 
DNA is a chemically and mechanically robust biopolymer that serves as a code and a memory but has almost 
no enzymatic or catalytic activity (Noireaux et al. 2011). However, all necessary transcription and translation 
components are encoded in genes, i.e. DNA, which is also the basis for proteins that upon translation perform 
the desired tasks within an organism. 
Artificial cells would be ideal containers for inserting new genetic modules or modifying existing ones. With the 
ability  to  generate  a  synthetic  specific  genome,  a  modified  genetic  code  could  be  defined  thus  affording 
additional  codons  for  the  incorporation  of  non-natural  amino  acids  (NNAA)  in  cellular  proteins.  Such  an 
incorporation of a variety of NNAA would allow the fabrication of novel proteins with novel functions (Moya et 
al. 2009). 
Non-natural  amino  acids  have  already  been  successfully  incorporated  into  proteins  using  several  strategies 
involving orthogonally evolved tRNA and rRNA synthases (Hendrickson et al. 2004), but this approach has been 
hampered  by  low  efficiencies  of  incorporation  due  to  competition  with  already  existing  codon  recognition 
factors. Expanding the repertoire of possible amino acids that the cell can use to build proteins is a powerful 
capability that will be readily available to any recoded chassis (Esvelt and Wang 2013). 
In all living cells the genetic code is limited to the common 20 amino acids (AA), with the rare exceptions of 
selenocysteine  and  pyrolysine.  The  genetic  code  is  expressed  by  aminoacyl-tRNA  synthetases,  the  enzymes 
that load specific AAs onto tRNAs. It was demonstrated (Liu and Schultz 2010) that mutating the active site of 
the  Methanococcus  jannaschii  tyrosyl-tRNA  synthetase  enabled  it  to  load  a  variety  of  non-natural  AA  onto 
target  tRNA  that  were  subsequently  assembled  into  proteins  in  Escherichia  coli.  Using  these  methods, 
numerous  NNAA  have  been  incorporated  into  proteins,  enabling  the  site-specific  labelling  of  proteins  with 
biophysical  probes,  photo-crosslinking  reagents,  fluorescent  groups,  heavy  atoms,  and  orthogonal  reactive 
groups (Filipovska and Rackham 2013). 
Despite  the  many  advances  in  expanding  the  genetic  code,  with  over  70  NNAA  successfully  added  to  date, 
these  approaches  have  been  almost  entirely  relied on  recoding  of the  rare  UAG  stop  codon.  Because  all  61 
sense codons are actively used by existing tRNAs carrying the 20 canonical AA it has been challenging to add 
multiple different NNAA to proteins within the same cells. One remedy would be to move beyond the existing 
set of triplet codons and use tRNAs with extended anticodons that recognise quadruplet codons. However, the 
efficiency of incorporation was very low, most  likely due  to the  ribosome’s  reduced ability to accommodate 
the  larger  anticodon.  To  solve  this  problem,  mutant-ribosomes  were  constructed  which  were  able  to  use 
quadruplet codons as efficiently as triplet codons (Filipovska and Rackham 2013). 

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
31 
NNAAs  can  be  synthesised  with  a  great  variety  of  side  chains.  These  techniques  were  expanded  to  yeast, 
mammalian  cells,  and multicellular organisms.  One  disadvantage  is  that  incorporation of  NNAA  by  replacing 
natural codons necessarily competes with natural processes (Marcheschi et al. 2013). 
Generally,  NNAA  introduce  new  chemical  functionality  to  directly  participate  in  the  enzymatic  mechanism. 
Examples  include  metal-ion  binding,  photoreactive  AA,  and  photocaged  AA.  Also  relevant  are  AA  that 
represent  a  post-translationally  modified  version  of  a  natural  AA.  Examples  include  sulfated,  methylated, 
nitrosylated, and recently phosphorylated AA (Marcheschi et al. 2013) 
RNA modifications 
Also RNA could be used to program synthetic cells, which seems far more complicated to build than a DNA 
cell (Noireaux et al. 2011). 
3.3
 
Building biological systems from parts 
In  line  with  the  principles  of  classical  engineering  synthetic  biology  aims  at  building  biological  systems  from 
basic components. On DNA level, basic components are promoters, operators, upstream activation sequences 
(UAS), ribosome binding sites (RBS), open reading frames (ORF), terminators etc. These “parts” are combined 
to create genetic circuits of increasing complexity following a systematic design framework. Current synthetic 
biology mainly  focuses on the  construction  and  optimisation  of  regulatory  devices  and  metabolic  pathways. 
The  creation  of  novel  genomes  from  parts  is  an  ultimate  goal  for  the  future  (Arpino  et  al.  2013;  Ellis  et  al. 
2011). 
3.3.1
 
Regulation of gene expression: parts and devices 
A part is a distinct DNA sequence which performs a defined function in a genetic circuit and is compatible with 
an assembly technique. A gene is an open reading frame (ORF) along with all regulatory elements required for 
successful expression. A functional gene or “composite part” usually consists of a promoter, a translation start 
site (the RBS in prokaryotes), the protein coding ORF and a terminator. Assembly of a gene from its individual 
parts functionally requires ordered assembly. One of the foundational advances of synthetic biology was the 
BioBrick™, a DNA unit with standardised flanking sequences that enables assembly to be achieved by a cheap, 
simple  and  standardised  restriction/ligation  method.  With  BioBricks™  it  became  possible  to  store  pots  of 
modular  biological  parts  that  could  be  shared  and  easily  assembled  in  different  combinations  by  a  vibrant 
community. 
A  pathway  is  a  group  of  genes  or  operons  (multi-ORF  genes)  which  may  perform  related  functions.  Such 
pathways,  devices  and  regulatory  networks  could  be  used  for  integrated  assembling  to  build  synthetic 
designer  genomes  or  chromosomes  for  custom  organisms.  Research  in  this  area  is  already  active  and 
beginning to bear fruit (Ellis et al. 2011). 
Regulatory  elements  are  of  pivotal  importance  for  designing  predictable  systems  (Boyle  and  Silver  2009). 
Regulation  is  achieved  at  several  levels  in  biological  systems:  transcription,  RNA  processing,  translation, 
protein-protein  interactions,  and  protein-substrate  interactions.  Spatial  and  temporal  organisation  of  these 
control  systems  ensures  their  proper  function.  In  particular  proteins  may  interact  with  any  suitable  binding 
partners, regardless of the cellular compartment. Synthetic proteins may be rearranged and thereby yield new 
behaviour.  In  synthetic  systems,  the  metabolism  may  be  optimised  at  many  scales  (compartmentalisation, 
proteins –  substrate  channelling, scaffolding of complexes, enzymes  –  electron transfer in mitochondria and 
chloroplasts (Agapakis et al. 2012). 
Many  new  biological  parts,  like  organelle-targeting  sequences,  transmembrane  transporters  and  bacterial 
microcompartment (BMC) pores, need to be characterised for efficient intracellular engineering  (Agapakis et 

---