Информационный материал по курсу вуза «Биотехнология»

Kriosaqlash va uning asoslari

"Kriopreservatsiya" atamasicryopreservation, ya'ni ob'ektlarni juda past haroratda saqlash (odatda suyuq azot haroratida, ya'ni id96 °C),
anabioz holatida tirik hujayralar, to'qimalar va organlarning cheksiz uzoq saqlanishini ta'minlaydigan murakkab ko'p bosqichli jarayonni ko'rsatish uchun ishlatiladi. Kriosaqlashning asosiy mezoni hayotiy jarayonlarning qaytariladigan inhibisyonidir. Faqat chuqur to'xtatilgan animatsiya holatida, metabolik, biokimyoviy reaktsiyalar to'liq to'xtaganda va suyuqlik fazasi bo'lmaganda, biologik tizimni uzoq muddatli saqlash uchun sharoitlar yaratiladi, so'ngra normotermiya sharoitida uning boshlang'ich holatiga to'liq qaytariladi.
Ushbu muammoni hal qilishning yagona ishonchli vositasi suyuq azotdan foydalanish bilan ta'minlangan chuqur sovuq (-140 °C va undan past).
Kriosaqlash jarayonining eng muhim bosqichi muzlatishdir. Hozirgi vaqtda kriosaqlashning ikkita usuli ma'lum: dasturiy ta'minot (sekin) va juda tez muzlatish. Dasturiy ta'minotni muzlatish uzoq vaqtdan beri o'rganilgan, shuning uchun u hayvonlar va o'simlik hujayralarini saqlashda juda keng qo'llaniladi. Ultra tez muzlatish nisbatan yaqinda ishlab chiqilmoqda, ammo bu usul kelajak deb hisoblanadi.
Ushbu bosqichda qiyinchiliklar yuzaga keladi, chunki kriosaqlanadigan ob'ektlarning ikki guruhi mavjud:
- suv miqdori minimal bo'lgan to'qimalar (Polen, pravoslav urug'lari). Bunday ob'ektlar uchun muzlatish jarayoni juda oddiy: ular to'g'ridan-to'g'ri suyuq azotga botirilishi va keyinchalik normal sharoitda havoda erishi mumkin;
- ko'pchilik o'simlik to'qimalari. Ular hujayralarning katta o'lchamlari, kuchli tsellyuloza devori va Markaziy vakuolaning mavjudligi bilan ajralib turadi. Bundan tashqari, bu past harorat ta'siriga qarshilik ko'rsatishda asosiy rol o'ynaydigan hujayraning vakuolizatsiya darajasi (suvlilik). Bunday ob'ektlar uchun oddiy muzlatish usuli samarasiz, chunki barcha boshlang'ich xususiyatlar va hayotiylik saqlanib qolmaydi.
O'simlik hujayralarini, ayniqsa in vitro sharoitda o'stiriladigan o'simliklarni kriosaqlash ishlarini in vitro, olib borishda kichik vakuolali va 200 suv miqdori kamaygan kichik hujayralarni tanlash kerak. Har bir alohida holatda muzlatish va keyinchalik eritish shartlarini ishlab chiqish kerak. Bu muzlashda namoyon bo'ladigan ikkita zarar etkazuvchi omil bilan bog'liq. Ulardan birinchisi muz, u birinchi navbatda hujayralar atrofidagi eritmada paydo bo'ladi; ikkinchisi — bu hujayradan tashqari muzning kristallari hosil bo'lishi natijasida hosil bo'lgan hujayralarning suvsizlanishi. Shuning uchun, muzlatish-eritish paytida himoya eritmasining harorati va -40 °C harorat (kamdan — kam hollarda -70 °C gacha) orasidagi zonani eng kam hayotiy yo'qotish bilan chetlab o'tish kerak. Aynan shu harorat zonasida ikkala zararli muzlash omillarining ta'siri namoyon bo'ladi, ularning har biri xavfli, chunki u tashqi hujayra membranasi — plazmalemmaning yo'q qilinishiga va shuning uchun hujayralar o'limiga olib kelishi mumkin.
Kriosaqlashning birinchi vazifasi hujayralar ichida muz kristallari paydo bo'lishining oldini olishdir. O'simlik hujayralari holatida, ularda erkin suv ko'pligi sababli, boshqa narsalarga qaraganda, uni hal qilish qiyinroq. Ushbu qiyinchilikni sovutish tezligini pasaytirish yoki hujayralarni oldindan suvsizlantirish orqali bartaraf etish mumkin. Ma'lumki, hujayradagi suv qancha ko'p bo'lsa, muzlash tezligi shunchalik past bo'lishi kerak. Boshqa tomondan, hujayralarni oldindan suvsizlantirish ularning suvsizlanish bilan bog'liq shikastlanishiga olib kelishi mumkin.
Kriyosozlashning ikkinchi vazifasi muqarrar suvsizlanish natijasida yuzaga keladigan stress ta'sirini engillashtirishdir. Buning uchun protektor aralashmasining ma'lum bir tarkibi va optimal muzlash tezligi talab qilinadi. Kriosaqlash jarayonining butun dasturini optimallashtirish ham maqsadga muvofiqdir.
Tizimli fundamental va amaliy tadqiqotlar olib borishda, tashkilotning turli darajalaridagi biologik tizimlarning kriyozararlanish va kriyozararlanish mexanizmlari aniqlanadi. Ulardan ba'zilarini ko'rib chiqing:
1. Hujayra ichidagi muz hosil bo'lishining oldini olish. Ko'pgina hollarda hujayra protoplastda muz hosil bo'lganda o'ladi, chunki uning tuzilmalari uchun faqat 0,1 mikrondan oshmaydigan muz kristallari xavfsizdir.
Haroratning tez pasayishi (20 °C/min) bilan protoplastda kristallanish markazlari bo'lgan juda kichik muz kristallari hosil bo'ladi. Ular protoplastdan suv molekulalarini biriktirish orqali tez o'sadi. Hosil bo'lgan katta muz kristallari hujayralarga, asosan membranalarga va hujayra tuzilmalariga mexanik ravishda zarar etkazishi mumkin.
Sekin muzlash paytida (suyuq azot bug'ida yoki maxsus dastur muzlatgichlarida) muz birinchi navbatda hujayralararo bo'shliqlarda hosil bo'ladi. Ularda kamroq konsentrlangan eritmalar tezroq muzlashi ma'lum. Sovutganda, apoplastda paydo bo'lgan muz kristallari suv bilan o'sadi. Muz hujayralardan hujayralararo hujayralarga yo'naltirilgan suv potentsialining gradientini hosil qiladi. Bu asta-sekin hujayralarning suvsizlanishiga va natijada oqsillarning denaturatsiyasiga, membranalarning ishlamay qolishiga, ion kontsentratsiyasining toksik miqdorlarga ko'payishiga va normal hujayra oqsillari sintezining buzilishiga olib keladi.
Hujayradan tashqari muzning paydo bo'lishi va hujayralardan suv chiqishi hujayralar apoplastga chiqaradigan maxsus moddalar tomonidan rag'batlantiriladi. Bunday birikmalar nukleatorlar, jarayonning o'zi esa nukleatsiya deb ataladi. Ushbu moddalar suvning kristallanish markazlari (urug') rolini o'ynaydi va shu bilan muzning yadrolanish chegarasini oshiradi. Yadrolar tufayli hujayralararo muz hujayra ichidagi muhitni muzlatish uchun zarur bo'lgan haroratdan yuqori haroratda hosil bo'ladi.
Shunday qilib, protoplastning asta-sekin suvsizlanishi hujayralarning muzlashdan omon qolishi uchun zarur shartlardan biridir.