Информационный материал по курсу вуза «Биотехнология»

Madaniy muhit va madaniy sharoitlar
Hujayralarni to'qima yoki organizmdan ajratib olib, ularni madaniyatga joylashtirgandan so'ng, madaniy muhit hujayralar in vivo jonli bo'lgan barcha tashqi sharoitlarni ta'minlashi kerak. Bu hujayralarning omon qolishini, ularning ko'payishini va farqlanishini ta'minlaydi. Hujayradan tashqari muhit hujayralarni ozuqaviy va gormonal omillar bilan ta'minlashi kerak, ya'ni hujayralarning o'sishi va omon qolishi uchun zarur bo'lgan barcha narsalarga ega bo'lishi kerak.
Hayvonlar va inson hujayralari madaniyati suyuq (o'sish muhiti), gazsimon (gazlar kontsentratsiyasi) va qattiq (substrat yuzasi) fazaga ma'lum talablarni qo'yadi. O'sish muhiti ma'lum bir tarkibdagi eritma bo'lib, unga noma'lum biologik kelib chiqadigan tarkibiy qismlar (plazma qo'shimchalari, qon zardoblari, to'qima ekstraktlari va boshqalar) qo'shiladi. Oziqlantiruvchi vositalarning asosi sho'r eritmalardir. Ushbu eritmalardagi mineral komponentlar shunday tanlanganki, eritma bufer funktsiyalarini bajaradi, madaniyat jarayonida muhitning doimiy kislota-ishqor muvozanatini saqlaydi. Muhitning pH doimiyligi etishtirish sharoitlarining asosiy talablaridan biridir.
Earl va Henks tuzli eritmalari odatda ozuqa moddalarini tayyorlash uchun ishlatiladi. Ushbu eritmalar, dulbekko va Vogta fosfatnosol buferi kabi, ekinlarni o'tkazish, hujayra liniyalarini ajratish va hujayra madaniyati bilan boshqa manipulyatsiyalarda hujayralarni sug'orish va yuvish uchun ham ishlatiladi. Kultivatsiyaning yana bir muhim sharti osmotik bosimdir. U 1 kg erituvchi (osmolyarlik) yoki 1 litr eritma (osmolyarlik) uchun osmotik faol zarralar (ionlar va ionlashtirilmagan molekulalar) mollari soni bilan belgilanadi. Suyultirilgan suvli eritmalarda bu qiymatlar yaqin. Eritmaning osmolyalligi (osmol/kg) \ u003d S m_i*x_i, bu erda m_i i-erigan moddaning konsentratsiyasi (mol/kg), x_i uning molekulasi dissotsiatsiya qilingan zarralar soni. Masalan, Erl eritmasi uchun osmolyallikning hisoblangan qiymati 310,6 mosmol/kg, haqiqiy 283 ga teng. Hujayra ko'payishi sodir bo'ladigan pH va osmolallik diapazonlari tor va hujayra turiga qarab o'zgaradi. Masalan, inson diploid fibroblastlarining klonal o'sishi uchun wi38 optimal pH \ u003d 7.30 + 0.15 va osmolyallik 285 + 40 mosmol/kg, tovuq embrionidan fibroblastlar uchun mos ravishda 7.12 + 0.18 va 300 + 20. Ko'pgina muhitlarda pH ni ushlab turish uchun bikarbonat buferi ishlatiladi: HCO₃ \ u003d CO₂ + OH, agar karbonat angidrid chiqarilsa, oh kontsentratsiyasi oshadi. Eritmalarda oz miqdordagi bikarbonat buferi (Henks eritmasi) bo'lishi mumkin, ular pH ni mahkam yopiq idishlarda ushlab turish uchun mo'ljallangan. Boshqalarida (Erl eritmasi) bikarbonat ko'proq, ular Co 2 qisman bosimi yuqori bo'lgan tizimlarda qo'llaniladi₂. Agar ekinlar₂pH ni saqlash qiyinroq bo'lgan CO 2 inkubatoridan tashqarida olib borilsa, muqobil bufer tizimlari talab qilinadi. Yaxshi bufer HEPES 4 - (2-oksietil)1-piperazinetansulfonik kislotadir. HEPES suvda oson eriydi, ikki valentli kationlarni bog'lamaydi, 0.05 mol konsentratsiyasiga qadar sitotoksik emas. 0.01 0.03 m konsentratsiyalarda qo'llaniladi.
Hayvon hujayralari madaniyatini boshqarish uchun standart muhit. Medium Иглаmem (minimal essential medium) va BME (basal medium, Eagle) ignalari. Mem tez-tez ishlatiladi. Uning tarkibida uglevodorod substrat vazifasini bajaradigan minerallar, aminokislotalar (13 muhim), 6 suvda eriydigan vitaminlar, xolin va Inositol mavjud. Mem faqat zardob bilan ishlatiladi, chunki unda biotin, B12 vitamini, temir ionlari va iz elementlari yo'q. Ning asosi Earl eritmasi.
Dulbekko muhiti DME yoki DMEM (igna muhitini ikki marta o'zgartirish). U har xil turdagi hujayralarni, shu jumladan transformatsiyalanmagan hujayralarni va gibridni etishtirishda ishlatiladi. Bu aylanma bo'lmagan muhit uchun asosdir. Aminokislotalarning ikki tomonlama konsentratsiyasi, glitsin, serin, piruvat, temirni o'z ichiga oladi. Ushbu vositadan foydalanganda 10% CO2 konsentratsiyali inkubator kerak bo'ladi.
Iskova muhiti IMDM - modifikatsiya dulbekko muhiti. Muhim aminokislotalar, biotin,_{b 12 vitamini,} natriy selenit qo'shildi. Chorshanba kuni HEPES joriy etildi va NaCl va NaHCO_{3 kontsentratsiyasi kamaydi}. Muhit sarumsiz bo'lib, odatda limfotsitlar va gematopoetik hujayralarni etishtirish uchun ishlatiladi.
Makkoy muhiti 5A va rpmi muhit seriyasi. Makkoy 5A muhiti 1958 yilda Uoker 256 karsinosarkomasi hujayralarining sarum, so'ngra boshqa birlamchi madaniyatlar va turli hujayra liniyalari ishtirokida klonal o'sishini ta'minlash uchun ishlab chiqilgan. Odatda Ivkat va Grace (RPMI) modifikatsiyasida ishlab chiqariladi va zardob ishtirokida oq qon hujayralarini etishtirish uchun mo'ljallangan, ko'pincha gibrid etishtirish uchun ham ishlatiladi. ₂Kultivatsiya paytida atmosferada Co 2 kontsentratsiyasi 5% ni tashkil qiladi.
199-muhit 1950 yilda tovuq embrionidan yurak bo'laklarini etishtirish uchun ishlab chiqilgan. Atrof-muhit ozuqa moddalarining keng doirasi va ularning past konsentratsiyasi bilan ajralib turadi. U qo'shimchalarsiz, birlamchi hujayralar uchun qo'llab-quvvatlovchi sifatida, zardob bilan esa tez ko'payadigan hujayralar uchun o'sish vositasi sifatida ishlatiladi. Oddiy, o'ziga xos funktsiyalarni saqlaydigan hujayralar standart muhitda ko'paymaydi (agar o'zgartirilmasa). Hujayralarning optimal o'sishi uchun odatda xomilalik (embrion) sarumning 5-20% qo'shiladi.
Sarum kichik va katta molekulalarning juda murakkab aralashmasi bo'lib, hujayra o'sishini keltirib chiqarishi va inhibe qilishi mumkin. Sarumning asosiy funktsiyalariga quyidagilar kiradi: hujayralar o'sishini va ularning funktsiyalarini rag'batlantiradigan gormonal omillar bilan ta'minlash; hujayralarning biriktirilishi va tarqalishi omillari bilan ta'minlash; gormonlar, minerallar, lipidlar va boshqalarni tashiydigan transport oqsillari bilan ta'minlash.
O'sish omillarining aksariyati zardobda bir millilitr va undan past bo'lgan bir nechta nanagramlar konsentratsiyasida mavjud. Ushbu omillarning ba'zilari differentsiatsiyaning ma'lum bir bosqichidagi hujayralarga xosdir, boshqalarning ta'siri faqat bitta hujayra turi bilan cheklanmaydi. Xuddi shu turdagi hujayralarni turli xil o'sish omillari rag'batlantirishi mumkin. Masalan, fibroblastlar fibroblastlarning o'sish omiliga, epidermisning o'sish omiliga, trombotsitlar va somatomedinlar tomonidan sintez qilingan o'sish omiliga javoban ko'payadi. Bu moddalarning barchasi mitogenlardir (mitozni rag'batlantiradi). Deyarli barcha hujayra turlari uchun o'sishning yana bir muhim omili insulin gormonidir. Boshqa gormonlar orasida glyukokortikoidlar (gidrokortizon, deksametazon), steroidlar (estradiol, testosteron, progesteron) va qalqonsimon gormonlar (triiodotironin) eng ko'p ishlatiladi. Gormonlar hujayra turiga va ularning zichligiga qarab o'sishni rag'batlantiradi yoki inhibe qiladi. Masalan, glyukokortikoidlar o'sish omillariga sezgirligini o'zgartirib, hujayra proliferatsiyasiga ta'sir qiladi.
Past molekulyar og'irlikdagi omillarni (vitaminlar, aminokislotalar, lipidlar va boshqalar) o'tkazish uchun transport oqsillari kerak. Albumin bu rolda. Temirni tashish transferrinni ta'minlaydi va ko'pchilik madaniy hujayralar yuzasida bu protein uchun retseptorlar mavjud. Hujayralarning biriktirilishi va tarqalishi omillariga kollagen va fibronektin kiradi, xondronektin (xondrositlarning yopishishi) va laminin (epiteliya hujayralarining yopishishi) ko'proq ixtisoslashgan.
So'nggi yillarda hujayralarni ko'paytirish uchun sarumsiz muhitlar ishlab chiqilgan. Ko'pincha, bu muhitlar tor ixtisoslashgan, ya'ni.ma'lum bir hujayra turi uchun mo'ljallangan. Asosiy muhitga insulin, transferrin, gidrokortizon yoki uning analogi deksametazon va boshqalar qo'shiladi.Sarumsiz muhitlar ma'lum afzalliklarga ega: atrof-muhit tarkibining barqarorligi tufayli tajriba natijalarining takrorlanuvchanligini yaxshilash; madaniyatni viruslar, zamburug'lar, mikoplazma bilan yuqtirish xavfini kamaytirish; hujayra metabolizmi mahsulotlarini tozalashni osonlashtirish; biologik tadqiqotlar natijalariga qo'shimcha oqsillarning ta'sirini kamaytirish; sarum sitotoksikligining yo'qligi. Sarum ishtirokida hujayralarni etishtirish bir qator kamchiliklarni ham aniqlaydi: ko'pgina to'qimalar uchun sarum asl to'qimalarda aloqa qilgan fiziologik suyuqlik emas, shuning uchun, masalan, sarum fibroblastlarning o'sishiga olib keladi, ammo epidermal keratinotsitlarning o'sishiga to'sqinlik qiladi; sarum sitotoksik bo'lishi mumkin, chunki tarkibida poliaminlarga ta'sir qiluvchi poliamin oksidaza (spermin, spermidin)mavjud. tez ko'payadigan hujayralar sekretsiyasi mahsulotlari (embrion zardobida bunday fermentning nisbatan ko'p qismi mavjud); turli partiyalarning zardoblari tarkibidagi sezilarli o'zgaruvchanlik; sarumlarda etarli miqdordagi o'ziga xos o'sish omillari bo'lmasligi mumkin, bu ularni hujayra madaniyatlariga qo'shishni talab qiladi.
Ko'pgina sutemizuvchilar hujayralari ko'payishni boshlashdan va hujayra monoqatlamini hosil qilishdan oldin substratga yopishib, ustiga yoyilishi kerak. Shu munosabat bilan tegishli material haqida savol tug'iladi. Hozirgi vaqtda substrat sifatida bir nechta materiallar ishlatiladi. Shisha eng yaxshisidir pireks (aluminoborosilikat shisha), chunki natriy silikat shisha vositani ishqorlashi mumkin va uni iste'mol qilishdan oldin ozgina kislotada qaynatish kerak. Har foydalanish bilan bunday oynaning yaroqliligi pasayadi. Plastmassa-ko'pincha polistirol, polikarbonat, polivinilxlorid, teflon va boshqalar ishlatiladi. Metalllar-zanglamaydigan po'lat ham, titan ham mos keladi, chunki bu moddalar kimyoviy jihatdan inert va yuqori salbiy sirt zaryadiga ega. Hujayralar elektrostatik o'zaro ta'sirlar orqali biriktiriladi, shuning uchun madaniyat tomirlarining yuzasi namlangan va manfiy zaryadlangan bo'lishi kerak. Bunga oksidlovchi moddalar yoki fizik ta'sirlar (yuqori voltli zaryadsizlanish, ultrabinafsha nurlar, yuqori energiyali elektronlar bilan bombardimon qilish) bilan kimyoviy ishlov berish orqali erishish mumkin. Plastik idishlar ishlab chiqaradigan firmalar ushbu usullardan foydalanadilar. Ba'zi tadqiqotchilar, shunga qaramay, hujayralarni ekishdan oldin konsentrlangan sulfat kislota va kaliy bixromat (xrom aralashmasi) aralashmasi bilan ishlov berishni, so'ngra yaxshilab yuvishni afzal ko'rishadi. Ba'zida idishning yuzasi hujayralar biriktirilishini osonlashtiradigan modda bilan qoplanadi. Buning uchun ko'pincha kollagen va poliamin kislotalar ishlatiladi.
Hujayralarni etishtirishning ikkita asosiy tizimi mavjud.
1. Oqimsiz ekinlar-hujayralar muhitning belgilangan hajmiga kiritiladigan madaniyat turi. Hujayralar o'sishi bilan ozuqa moddalarini ishlatish va metabolitlarning to'planishi sodir bo'ladi, shuning uchun atrof-muhit vaqti-vaqti bilan o'zgarishi kerak, bu esa fiziologik differentsiatsiya deb ataladigan hujayra metabolizmining o'zgarishiga olib keladi. Vaqt o'tishi bilan atrof-muhitning tükenmesi natijasida hujayralar ko'payishi to'xtaydi.
Oqimsiz ekinlarning umrini ko'paytirishning bir necha yo'li mavjud:

• 
  intervalgacha (madaniyatning bir qismi teng miqdordagi yangi muhit bilan almashtiriladi);
  
• 
  doimiy (madaniyat hajmi doimiy past tezlikda ko'payadi va hujayralarning kichik qismlari vaqti-vaqti bilan olib tashlanadi);
  
• 
  perfuzion (yangi muhit madaniyatga doimiy ravishda kirib boradi va bir vaqtning o'zida ishlatilgan (hujayrasiz) muhitning teng hajmini olib tashlaydi).
  
• 
  Perfuziya butun muhit tizimdan chiqarilganda ochiq bo'lishi mumkin va olib tashlangan muhit uning pH darajasi tiklanadigan va shamollatish amalga oshiriladigan qo'shimcha idishdan o'tib, madaniyat idishiga qaytganda yopiq bo'lishi mumkin.
  

Oqimsiz ekinlarning barcha tizimlari chiqindilarning u yoki bu shaklda to'planishi va tashqi sharoitlarning nomuvofiqligi bilan ajralib turadi.
2. Oqim madaniyati ozuqa moddalari va metabolitlar kontsentratsiyasini va hujayralar sonini o'zgartirmasdan haqiqiy gomeostatik sharoitlarni ta'minlaydi. Gomeostaz muhitning madaniyatga doimiy kirib borishi va bir vaqtning o'zida hujayralar bilan teng miqdordagi muhitni olib tashlash bilan bog'liq. Bunday tizimlar suspenziya ekinlari va mikro tashuvchilarda bir qatlamli ekinlar uchun javob beradi.
Hayvon hujayralarini etishtirishda ikkita katta yo'nalish mavjud: bir qatlamli ekinlar va suspenziya ekinlari.