Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

SOS Chromotest a UmuC test na cisEHMC a standardu EHMC

1. SOS Chromotest

Byl proveden SOS Chromotest dle postupu uvedeného v kapitole 3. Materiály a metody. Testovali jsme ozářený vyizolovaný vzorek cisisomeru EHMC a neozářený standard EHMC. Vzorky byly naředěny dle následujícího postupu:

10 µl EHMC o koncentraci 800 mg.ml¹ bylo pipetováno do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek. Byla provedena ředící řada o čtrnácti koncentracích v ředícím poměru 1:1 (10 µl vzorku + 10 µl DMSO). Při ředění byla zachována stejná finální koncentrace DMSO ve všech variantách.

Každá koncentrace vzorků byla testována v triplikátu. Jako pozitivní kontrola byl použit standardní mutagen 4NQO (c = 0,469 µg.ml¹), jehož indukční faktor měl hodnotu 22,06 (což je ve shodě se standardní odpovědí). Nebyl zaznamenán indukční efekt převyšující 50 % INH. Pouze u neozářeného vzorku v koncentraci c = 0,25 mg.ml¹ byla zaznamenána inhibice 44,06 ± 11,57. Hodnota byla proto z grafu vyškrtnuta (viz graf 22).



Graf 21: Závislost indukčního faktoru na koncentraci vzorku izolovaného cisEHMC v reakční směsi. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická.



Graf 22: Závislost indukčního faktoru na koncentraci vzorku neozářeného standardu v reakční směsi. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická.

SOS Chromotest vykázal genotoxický potenciál pouze u neozářeného EHMC a to u koncentrací 2 až 8 mg.ml¹. CisEHMC nevykázal genotoxický potenciál v žádné koncentraci. V tomto případě je možné, že genotoxicita neozářeného EHMC byla způsobena nečistotami, které látka obsahovala nebo přípravou samotné látky ve výrobě. Genotoxický potenciál látky vykázaly také testy na ozářeném EHMC, kde se vyskytovaly isomery cis a trans ve směsích. V těchto směsích bylo cisEHMC obsaženo ve 25 až 40 %. Opakovaně byl prokázán genotoxický potenciál až do koncentrace 2 mg.ml¹.

Další hypotéza, která se nabízí, je skutečnost, že látka je lipofilní, proto přidání LB média (které má vodný základ) u nejvyšší dávky, způsobuje vznik slabého precipitátu, který by mohl ovlivnit měření absorbance a případně i samotnou expozici a biodostupnost. Tato hypotéza by ale mohla být uvažována pouze u nejvyšších dávek. Dále se nabízí možnost, že ONPG substrát není zcela vhodným substrátem, jelikož kolorimetrická změna z bezbarvé do žluté není dostatečně kontrastní k této látce. Při ozařování v rozpouštědle hexan i ACN bylo zaznamenáno zažloutnutí vzorku, které však bylo po separaci cisisomeru odstraněno. Nepodařilo se nám identifikovat původ zažloutnutí vzorku, ale pokud by bylo jakkoliv spojeno s ozařováním, tedy s expozicí na světle, dá se předpokládat, že k nekontrolovatelnému zažloutnutí by mohlo docházet i při manipulaci se vzorkem či při samotném testu.

Rozhodli jsme se do laboratoří zavést inovovanou metodu UmuC testu s použitím CPRG substrátu, který má při reakci na aktivitu βgalaktosidázy výraznější kolorimetrickou změnu. Barví se z původní žluté barvy do výrazně červené.

2. UmuC test

Byl proveden UmuC test dle postupu uvedeného v kapitole 3. Materiály a metody. Testovali jsme ozářený, vyizolovaný vzorek cisisomeru EHMC a neozářený standard EHMC. Vzorky byly naředěny dle následujícího postupu:

5 µl EHMC o koncentraci 800 mg.ml¹ bylo pipetováno do vysterilizovaných Ependorf mikrozkumavek. Byla provedena ředící řada o dvanácti koncentracích v ředícím poměru 1:1 (5 µl vzorku + 5 µl DMSO). Při ředění byla zachována stejná finální koncentrace DMSO ve všech variantách. Každá koncentrace vzorků byla testována v triplikátu. Jako pozitivní kontrola byl použit standardní mutagen 4NQO (PK1: c = 0,2345 µg.ml¹ a PK2: c = 0,117 μg.ml¹). Hodnoty indukčního faktoru při použití substrátu CPRG byly rovny IF_PK1 = 71,85 ± 2,76 a IF_PK2 = 38,42 ± 6,76. Hodnoty indukčního faktoru při použití substrátu ONPG byly rovny IF_PK1 = 22,20 ± 0,58 a IF_PK2 = 15,07 ± 1,48.

Žádná z koncentrací testovaných látek nevykázala ΔD < 0. Growth factor byl > 0,5.


Graf 23: Výstup z testování genotoxicity izolovaného cisEHMC na modelu UmuC test za použití substrátu CPRG. Graf závislosti indukčního faktoru na koncentraci cisEHMC. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická.



Graf 24: Výstup z testování genotoxicity neozářeného standardu EHMC na modelu UmuC test za použití substrátu CPRG. Graf závislosti indukčního faktoru na koncentraci neozářeného standardu EHMC. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická.

Byl zaznamenán velmi mírný genotoxický efekt u vyizolovaného cisEHMC a to pouze v koncentraci 0,5 mg.ml¹ kdy hodnota IF byla 1,4608 ± 0,0312. Neozářený standard EHMC nebyl genotoxický v žádné z koncentrací. Byly zaznamenány rozdíly v odpovědi při použití CPRG (graf 23, 24) a ONPG (graf 25, 26) substrátu na modelu UmuC test. Při použití substrátu CPRG byly odpovědi v testu o něco vyšší. Z výsledků lze usuzovat, že použití substrátu CPRG je pro vzorky EHMC vhodnější. Výsledky testů s ONPG dobře kopírovaly odpovědi v substrátu CPRG, pouze jsou hodnoty indukčního faktoru v nižších hodnotách.

Graf 25: Výstup z testování genotoxicity neozářeného standardu cisEHMC na modelu UmuC test za použití substrátu ONPG. Graf závislosti indukčního faktoru na koncentraci cisEHMC. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická.



Graf 26: Výstup z testování genotoxicity neozářeného standardu EHMC na modelu UmuC test za použití substrátu ONPG. Graf závislosti indukčního faktoru na koncentraci neozářeného standardu EHMC. Červená linka znázorňuje hranici IF = 1,5, od které je příslušná koncentrace vzorku genotoxická.

Odpovědi v testech genotoxicity na modelu SOS Chromotest a UmuC test se lišily. Jedná se o velmi podobné testy, které však používají jiný modelový organismus. V SOS Chromotestu je to komenzální bakterie E. coli a v UmuC testu fakultativně intracelulární patogen Salmonella typhimurium. Tyto dva prokaryotické druhy mohou být považovány za fylogeneticky velmi podobné a mají společnou velkou část genetického materiálu, který bývá označován jako „core genome“. Přes tento společný základní genom mají oba druhy velmi odlišný styl života a není zcela jasné, jak významnou roli v tomto rozdílném způsobu života hraje jejich základní genom (na rozdíl od druhově specifických genů). Studie (Meysman et al. 2013) se zaměřuje na rozdíly v expresi domén orthologních genů v E. coli a v S. typhimurium. Bylo zjištěno, že zachování genové exprese se vyskytuje převážně nezávisle na podobnosti aminokyselin. Dle jejich odhadů má E. coli více než čtvrtinu orthologních genů s jinou doménovou expresi než je tomu u S. typhimurium. Geny zabývající se klíčovými buněčnými procesy pravděpodobně zachovávají doménovou expresi. Naproti tomu geny spojené s metabolickými procesy a přítomné u obou druhů vykazují odlišnou doménovou expresi a jsou tedy regulovány odlišně. Autoři se domnívají, že hlavní příčinou rozdílnosti exprese genů je patogenita S. typhimurium na rozdíl od komenzální E. coli. Další studie by měly být zaměřeny na výzkum právě patogenních znaků S. typhimurium, jelikož jsou přítomny i v nepatogenní E. coli, ale zdá se, že zde plní jinou funkci než u S .typhimurium, o čemž svědčí jejich rozdílná exprese.

2.