The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

40 
Chapter I 
to  assign  the  chemical  shifts  to  specific  peptide  residues.  Due  to  this  complexity 
unfortunately it could not be determined which peptide residues might have showed an 
increase in signal intensity upon small molecule addition.  
 
Table  2.1:  Possible  peak  assignments  based  on  HNCA  and 
15
N-NOESY  experiments.  The  first 
line displays the peptide sequence. Rows below show peak numbers with possible assignments to specific 
peptide residues. Numbers in parenthesis show C
α
 chemical shifts in ppm. Numbers with matching color 
indicate sequences of identical peaks which can be assigned to different peptide residues. Peak numbers 
refer to peaks indicated in the tr-HSQC spectrum in figure 2.9 (A).
 
 
E  N 
S 
V 
V 
H 
F 
F 
K 
N 
I 
V 
T 
S 
R 
 
 
36 
(58) 
24 
(61) 
60 
(63) 
8 
(53) 
33 
(55) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
(58) 
27 
(62) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
(58) 
27 
(62) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
(62) 
25 
(54) 
18 
(62) 
3 
(56) 
 
 
23 
(62) 
25 
(54) 
18 
(62) 
3 
(56) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
(55) 
5 
(59) 
 
 
 
 
9 
(55) 
5 
(59) 
 
 
 
 
 
7 
(49) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.3.8
 
Measuring 
19
F-NMR  spectra  of  J10-11  in  the  presence  of  HLA-DR2/MBP 
and HLA-DR2/CLIP 
To further investigate the binding of J10 and its derivatives to DR2 one-dimensional 
19
F-NMR spectra of the small molecule were measured in the presence of DR2/peptide 
complexes with different affinities. Some of the J10 derivatives include fluorine atoms 
which possess NMR active nuclei. 
19
F atoms are naturally abundant and have a nucleus 
with  spin  of  ½,  same  as  protons.  As  nuclei  with  spin  of  ½  undergo  splitting  of  spin 
states  in  an  external  magnetic  field  the  nuclei  can  be  excited  by  electromagnetic 
radiation yielding measurable NMR signals.  
The advantage of measuring 
19
F-NMR spectra instead of 
1
H-NMR spectra is that 
19
F-
NMR  signals  can  only  derive  from  the  small  molecule  as  the  protein  contains  no 
fluorines which simplifies the spectra. A one-dimensional 
1
H-NMR spectrum would be 

---

41 
Chapter I 
very difficult to interpret because of the large number of proton signals from the protein 
and  the  peptide.  For  the 
19
F-NMR  experiments  the  small  molecule  J10-11  was  used 
which contains four fluorine atoms, three at the indole ring and  one at the phenyl  ring 
(figure 2.1). 
The  NMR  signal  is  dependent  on  the  tumbling  rate  of  the  molecule  as  described 
above and therefore also the binding state of the small molecule. If the small molecule 
is free in solution it gives rise to very strong NMR signal as it tumbles fast. But as soon 
as it binds to the DR2 protein it tumbles very slowly and the NMR signal is very weak 
and  broad  and  can  only  be  detected  with  a  very  strong  magnetic  field  and  high  scan 
numbers.  However,  if  the  small  molecule  binds  to  the  protein,  less  small  molecule  is 
free  in  solution  resulting  in  reduced  intensity  of  the  NMR  signal  from  the  unbound 
small molecule. Therefore binding of the MHC II loading enhancer J10-11 to DR2 can 
be measured indirectly.  
The  analyses  of  the 
19
F-NMR  experiments  were  carried  out  qualitatively  by 
comparing  the  effect  of  adding  a  high  (DR2/MBP)  versus  a  low  (DR2/CLIP)  affinity 
MHCII/peptide complex to the small molecule J10-11. DR2/MBP and DR2/CLIP were 
prepared as described in 2.2.2. First the 
19
F-NMR spectrum of free J10-11 (250 μM) in 
50  mM  citrate  buffer  (pH  5.2)  was  measured  (figure  2.11)  which  gave  rise  to  four 
strong  signals.  Afterwards  DR2/MBP  or  DR2/CLIP  was  added  to  the  small  molecule 
sample at a concentration of 11 µM and the same 
19
F-NMR experiment carried out.  
Figure 2.11 shows an overlay of all three 
19
F-NMR spectra which were compared by 
matching  the  noise  level  and  the  signal  of  TFA  which  was  added  separately  as  a 
standard.  After  addition  of  the  high-affinity  complex  DR2/MBP  some  reduction  in 
signal  intensity  was  observed  compared  to  the  signal  of  the  small  molecule  without 
MHC II/peptide  present.  But  in  the  presence  of  the  low-affinity  complex  DR2/CLIP 
even more signal loss was detected. As the lower affinity complex led to more depletion 
of  free  J10-11  in  solution,  indicated  by  the  more  pronounced  signal  loss,  a  higher 
affinity  of  J10-11  to  the  low-affinity  complex  was  observed  than  to  the  high-affinity 
complex.  
 
 

---

42 
Chapter I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  2.11:  Comparison  of  three  different  one-dimensional 
19
F-NMR  spectra  of  the  MHC II 
loading  enhancer  J10-11  free  in  solution  (grey),  in  the  presence  of  DR2/MBP  (blue)  and  in  the 
presence of DR2/CLIP (green). The spectra were collected with a small molecule concentration of 0.25 
mM in 50 mM citrate buffer (pH 5.2) at 25 ºC using a  NMR machine  with a magnetic field strength of 
11.7 Tesla. The five peaks of the three different spectra are overlapping but for comparison the spectra of 
J10-11  in  the  presence  of  11  μM  DR2/MBP  (blue)  and  11  μM  DR2/CLIP  (green)  were  shifted  to  the 
right.  The  signal  on  the  right  refers  to  1  mM  TFA  which  was  added  to  the  NMR  tube  outside  of  the 
microcapillary. The three NMR spectra were compared by matching the peak height of the TFA standard 
and  the  noise  level.  Numbers  next  to  peaks  and  next  to  fluorine  atoms  of  the  small  molecule  J10-11 
displayed in the top left show the peak assignment. 
 
 
2.4
 
Conclusion 
To further improve the peptide loading activity of the small molecule J10, which has 
a potential as adjuvant for peptide therapeutics, a better understanding of the exchange 
mechanism is necessary. Two different methods were applied to gain a comprehensive 
understanding of the small molecule interactions with the MHC II/peptide complex and 
their impact on peptide-binding, i.e. X-ray crystallography and NMR spectroscopy.  
First,  DR2/MBP  was  crystallized  in  the  presence  of  the  J10  derivatives  J10-1  and 
J10-12  and  the  crystals  diffracted  till  2.9 Å.  A  data  set  from  a  co-crystallization  trial 
showed  extra  electron  density  close  to  the  peptide  N-terminus  in  the  region  around 
residue Ser α53. Previous experiments with covalent linkage of the small molecule to 
the peptide had shown that the small molecule binds in an area close to the peptide N-
terminus (Call et al., 2009). Also, mutagenesis studies of the α chain close to the peptide 

---